鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示:该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用于临床PCV2/PCV3感染的快速鉴别检测。

非洲猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10^(-1)~10^(5) copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%~3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PRRSV的最低检测模板浓度均为10 copies/μL;利用建立的二重FQ-PCR方法对130份临床样品进行检测,检测结果与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和HPPRRSV二重FQ-PCR检测方法,为ASFV和HP-PRRSV的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。

FQ-PCR检测BALF中结核杆菌-DNA对肺结核诊断的应用研究

目的:对FQ-PCR检测BALF中结核杆菌-DNA对肺结核诊断的应用进行研究。方法:随机选取2013年12月-2014年11月期间本院收治的肺结核患者110例作为本次研究的对象,所有患者实施纤支镜检查、活检、刷检,BALF中结核杆菌-DNA行FQ-PCR检测,对检查结果进行分析研究。结果:在本次研究中,确诊为肺结核的患者有40.00%(44/110);FQ-PC检测的敏感性明显高于常规涂片镜检,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在肺结核的诊断中,FQ-PCR检测的敏感度高,操作简单方便,检测速度较快,是BALF中结核杆菌-DNA检查的重要方法,在肺结核的诊断中有重要的应用价值。

FQ-PCR方法检测女性CA患者HPV_(6、11)和HPV_(16、18)的实验研究

目的:探讨女性尖锐湿疣(CA)患者HPV6、11型和HPV16、18型的感染情况。方法:采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测216例女性CA患者疣体组织或分泌物中的HPV6、11型和HPV16、18型。结果:HPV6、11型阳性率为94.91%(205/216),HPV16、18型阳性率为16.20%(35/216),HPV6、11型和HPV16、18型同时阳性的感染率为12.50%(27/216)。定量测定结果显示,HPV6、11型患者病毒载量最高1.0×108 copies/ml,最低2.8×103copies/ml;HPV16、18型患者病毒载量最高1.0×108 copies/ml,最低2.57×104 copies/ml。结论:FQ-PCR技术具有灵敏、简捷、安全、特异性强的特点,避免了单纯PCR扩增产生的假阳性。女性尖锐湿疣患者应用此方法检测HPV阳性率高,可以快速区分高危型及低危型的HPV感染,有助于对尖锐湿疣的复发和癌变作出可能性预测。

前列腺液HPV6/11 DNA FQ-PCR检测在无症状男性生殖道尖锐湿疣中的应用

目的:讨论FQ-PCR检测前列腺液HPV6/11 DNA在无症状男性生殖道尖锐湿疣诊断与治疗中应用价值。方法:自2012年1月至2013年6月,符合条件的患者72例患者入选该研究,对照组患者22例,均病检确诊尖锐湿疣。所有患者均积极治疗。在治疗前、后两组患者均行醋酸白实验,行前列腺液中HPV6/11DNA FQ-PCR定量分析,获得的结果进行统计学分析。结果 :在诊断无症状的男性生殖道尖锐湿疣隐匿性感染中,FQ-PCR方法优于醋酸白试验(P<0.05)。实验组和对照组在治疗前后各自前列腺液HPV6/11病毒量差异有统计学意义(P<0.05),治疗后两组之间差异不明显(P>0.05)。在治疗后3个月末HPV完全清除患者人数在实验组和对照组中无统计学差异(P>0.05)。结论:采用FQ-PCR法检测前列腺液中的HPV,能早期发现男性生殖道无症状尖锐湿疣潜伏期或亚临床期感染,为尖锐湿疣的早期诊断、治疗提供依据,也能评估治疗效果。

应用FQ-PCR方法快速产前诊断Down综合征

目的为探讨FQ-PCR方法快速、准确的应用于产前诊断Down综合征。方法分别提取46例外周血(包括16例确诊为Down综合征患儿和30例正常对照)和40例唐氏筛查高风险羊水细胞基因组DNA,FQ-PCR方法扩增基因D21S11、S100β(位于21号染色体)及基因UFD1L(位于22号染色体)。结果正常人羊水基因定量R1(D21S11/UFD1L)=1.095±0.213,R2(S100β/UFD1L)=1.087±0.146,Down综合征R1、R2分别为1.597±0.156、1.604±0.235,经t检验两组差异都有统计学意义。结论该方法无须细胞培养、操作简单,是一种快速准确产前诊断Down综合征的良好方法。

应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测孕妇巨细胞病毒感染

目的探讨荧光定量聚合酶链反应对孕妇巨细胞病毒（CMV）感染的临床诊断价值。方法用FQ—PCR检测1016例孕妇尿的CMV—DNA，同时用ELISA检测血中CMV IgG和CMV IgM。对20例感染孕妇的胎儿进行了产前诊断。结果FQ—PCR检测出36例CMV—DNA阳性，阳性率为3．5％（36／1016）；阳性样本CMV—DNA在3．9×10^5～6．8×10^8拷贝／ml之间，平均为4．23×10^5拷贝／ml；ELISA检测CMV—IgG阳性率72．83％（740／1016）；CMV—IgM阳性率3．15％（32／1016），CMV—IgG阴性率24．02％（244／1016）。20例产前诊断者有4例发生了宫内传播。结论FQ—PCR对CMV感染的诊断有重要的作用。

FQ-PCR检测解脲支原体及其药物敏感试验的临床应用

PCR技术应用方式有多种,在一般试验检测中,对PCR反应后产物的分析主要还是以琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳为主,操作繁琐费时,FQ-PCR检测技术近年来才研制成功,融汇了PCR技术的核酸高效扩增,探针杂交技术的高敏感高精确定量的优点,完全闭管操作,仪器直接读取PCR荧光信号的变化以获得定量的结果,并能克服常规PCR仅能定性不能定量,采用溴乙锭对人体有害及污染环境等缺点.

FQ-PCR与细胞培养检测女性HSV感染者宫颈排泌HSV的对照研究

目的:比较FQ-PCR与细胞培养方法检测无症状生殖器疱疹宫颈排泌HSV的阳性率。方法:用型特异性抗体-2型单纯疱疹病毒糖蛋白G-IgG(HSVgG2-IgG)筛选出阳性女性34例,每例连续2月每月在排卵期和月经前取宫颈拭子,共取材136个。每次取材的拭子分别使用细胞培养鉴定和荧光定量多聚酶反应(Fluorescent quantitation-polymerase chain reaction,FQ-PCR)检测宫颈分泌物中HSV。结果:FQ-PCR方法得到38个拭子阳性,均为HSV-2;细胞培养方法得到4个拭子阳性,经直接免疫荧光分型鉴定为HSV-2。即所有宫颈拭子HSV阳性标本均为HSV-2,无HSV-1。采用Mc-Nemer检验细胞培养与FQ-PCR检测结果阳性率的差异有统计学意义(P<0.05),FQ-PCR检测的阳性率比细胞培养法高。结论:对于女性无症状生殖器疱疹,FQ-PCR的方法检测宫颈排泌HSV优于细胞培养方法。

FQ-PCR技术对慢性乙肝患者血清与外周血单个核细胞HBV-DNA定量的对比分析

目的探讨慢性乙肝患者血清和外周血PBMC的HBV-DNA定量间的关系。方法采用FQ-DNA技术检测90例慢性乙肝患者血清和外周血单个核细胞的HBV-DNA含量。结果HBeAg阳性时,血清和PBMC的HBV-DNA阳性率均为100%,HBeAg阴性时,血清HBV-DNA阳性率为60.9%,PBMC阳性率为66.7%。另外当HBeAg(+)、HBV-DNA(+)时,PBMC阳性率为100%,HBeAg(-),HBV-DNA(+)时,PBMC阳性率为85.7%,HBeAg(-),HBV-DNA(-)时,PBMC阳性率为48.1%。结论同时进行HBV-DNA的血清学以及PBMC内检测十分重要,其检测结果在临床上对慢性乙肝患者的病情判断,治疗措施以及治疗效果的评价具有举足轻重的作用。

HBV携带者血清和白带HBV-DNA FQ-PCR检测分析

目的了解乙型肝炎病毒HBV携带者血清与白带中HBV-DNA含量的关系及其意义。方法选择经血清学检测诊断为女性HBV携带者867例,采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术测定其白带中和血清HBV-VA含量,并对所有检测指标进行相关性分析。结果867例携带HBV女性中,HbsAg、HbeAg、HbcAb三大阳者的血清和白带中HBV-DNA的阳性检出率均为100%;HbsAg、HbeAb、HbcAb三小阳组阳性率分别为85·6%和84·3%;HB-Ag、HBsAb两组的阳性率分别为86·6%和83·7%,白带HBV-DNA含量与血清HBV-DNA含量呈正相关(r=0·896),且白带HBV-DNA含量低于血清含量近101。结论白带与血清中HBV-DNA含量呈正相关。血清HBV-DVA阳性的育龄女性应作白带HBV-DVA检测,以对其阳性者采取防治措施,降低HBV母婴播率具有重要意义重大。

Line-geneK-FQ-PCR仪在检测结核菌中的质控问题

目的:探讨FQ-PCR技术在检测临床标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法:通过FQ-PCR技术鉴定561株临床分离株,进行结核分枝杆菌的菌种鉴定和定量分析,同时进行抗酸染色和培养法。结果:FQ-PCR、染色和培养法阳性检出率分别为38.8%(128/330),21.8%(72/330),29.7%(98/330),提高阳性检出率(涂阴)16.97% (56/330),菌种鉴定特异性实验符合率为100%。结论:FQ-PGR技术是一种快速、敏感、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法。

FQ-PCR检测161例女性HPV_(16)、HPV_(18)感染状况报告

目的为了解健康体检妇女和阴道炎患者人乳头状瘤病毒(HPV)16型和18型的感染状况。方法采用荧光定量聚合酶链反应技术,对99例健康体检妇女和62例阴道炎患者进行了HPV16、HPV18检测。结果在上述99例健康体检妇女中检测出、HPV18阳性标本1例,阳性率为1.01%,未检测到HPV16阳性标本;在62例阴道炎患者中检测出HPV16阳性标本6例,HPV18阳性标本1例,阳性率分别为9.68%和1.61%。结论在阴道炎患者中HPV16有较高的感染率。

草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用

草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到6个阳性质粒,有较高的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为0.82%与0.41%～0.52%,重复性强;对水生动物其他病毒均无扩增反应,具有很好的特异性。应用该方法对采集的32份草鱼出血病样品进行检测,其中28份为阳性,而以常规RT-PCR检测同样的样品,仅23份为阳性。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒流行株实时荧光定量PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面具有较好的测试结果,在GCRV的快速检测和病毒初步定量中应用前景乐观。

氮素胁迫下强、弱化感水稻萜类代谢途径中关键酶基因差异表达的FQ-PCR分析

运用实时荧光定量PCR技术研究低氮条件下化感与非化感水稻异戊二烯代谢途径中关键酶基因的表达差异。结果表明,与正常氮条件下相比,低氮条件下化感和非化感水稻与萜类物质合成相关的12个关键酶基因表达发生了不同程度的变化,其中,化感水稻PI312777有6个基因表达下调,6个基因则上调;而非化感水稻Lemont有7个基因表达下调,5个基因表达上调。在供氮条件从高向低改变的过程中,两水稻中有11个基因的表达行为(上调或下调)相同,从分子水平上,证实了它们萜类代谢相关基因在响应供氮环境变化的行为生态上是相同或相似的。低氮引起两水稻催化生成与化感物质相关的单萜、倍半萜、二萜、三萜类物质的合成酶基因表达量均显著下降,从而认为营养胁迫引起水稻化感抑草作用增强与萜类物质代谢变化无关。还讨论了营养胁迫引起萜类物质代谢变化与内源激素合成和生长速率减缓的关系,认为水稻甲羟戊酸代谢途径支路中3-羟基-3-甲基戊二单酰CoA合酶、3-羟基-3-甲基戊二单酰CoA还原酶和甲羟戊酸激酶相关基因表达量不同程度的上调,维持了生长所必需的激素水平。

草鱼呼肠孤病毒JX-0901株FQ-PCR检测方法的建立及其在定量分析中的应用

根据GCRV JX-0901株S7基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了针对GCRV JX-0901株病毒的TaqMan实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法,并利用FQ-PCR方法对该毒株在不同鱼类细胞中的增殖情况和不同温度条件下的稳定性进行了定量分析。结果显示,建立的FQ-PCR方法的Ct值与标准品在1.0×101～1.0×108拷贝/μL浓度范围呈良好的线性关系,R2高达0.999;该方法有较好的敏感性和特异性,最低模板检出量为10个拷贝,只能特异地检测出GCRV JX-0901,不能检出其他鱼类常见病毒。该毒株能在10种常见鱼类细胞中增殖,其中在L8824细胞中的增殖量最大,含量达到4.1933×107拷贝/μL;此外,该毒株对温度敏感性较弱,病毒在48、56℃条件下放置96 h后才失去对CIK细胞感染性,而在4、15、28、37℃条件下放置32d,-20℃条件下储存2年仍具有较高的含量和较强的感染性。

肠炎沙门氏菌种特异性FQ-PCR快速检测方法的建立

根据肠炎沙门氏菌（SE）种特异性DNA序列，设计合成了一对能特异性扩增130bp片段的引物和TaqMan探针，首次建立了SE的种特异性荧光定量聚合酶链式反应（FQ-PCR）诊断方法。该法在SEDNA含量为9×10^8-9X104拷贝有较好的线性关系；检测SEDNA模板的灵敏度为4拷贝／μL，检测SE细菌数的灵敏度为6CFU／mL；特异性试验表明只对SE基因组呈阳性反应。分别应用该技术和传统细菌分离法检测60份来自人工感染鸭、小白鼠和肉兔的心、肝、脑和直肠粪便，结果显示两种方法对心、肝、直肠粪便的阳性检测结果符合率为100％，而FQ-PCR对脑的阳性检测率极显著（P〈0．01）高于细菌分离。研究结果表明，该方法快速、灵敏、特异、重复性好且能实时定量检测，可用于SE分离鉴定、SE感染疑似病例检测、SE体内动态分布规律研究及其分子流行病学调查。

FQ-PCR测定HBV DNA与ELISA检测HBV-M相关性分析

目的探讨HBV DNA含量与HBsAg S/CO值之间的相关性。方法分别用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测100例乙肝患者的HBV DNA含量和乙肝两对半,并记录HBsAg S/CO值。结果100例乙肝患者HBV DNA含量对数值为(4.28±1.89),HBsAg S/CO值为(15.09±6.64),两指标间作相关性分析,r=-0.0156,P>0.05,无相关性。结论HBV DNA是判断乙肝病毒复制的较准确、较直接的抗乙肝病毒疗效观察指标,而HBsAgS/CO值的高低与疾病的严重程度及疗效无关。

FQ-PCR检测女性泌尿生殖道炎性反应患者解脲脲原体合并感染情况分析

目的分析女性泌尿生殖道炎性反应患者解脲脲原体(Uu)合并感染淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)的情况,用以指导临床进行正确的诊断和治疗。方法采用TaqMan探针荧光定量PCR技术,对205例女性泌尿生殖道炎性反应患者进行Uu、NG和CT检测。结果在205例女性泌尿生殖道炎性反应患者中检测出Uu感染率为52.68%(108/205),NG和CT感染率均为1.46%(3/205),并且女、男单项和混合感染率比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论在女性泌尿生殖道炎性反应患者中Uu有较高的感染率,但对拟诊为Uu的患者应同时进行NG、CT检测,以免由于漏检而延误患者治疗。

FQ-PCR检测HPV基因型的临床应用分析

目的了解人乳头瘤病毒感染患者HPV6,11型和HPV16,18型的分布。探讨HPV-DNA分型检测的临床应用价值。方法采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测1567例HPV感染者疣体组织或分泌物中的HPV6,11型和HPV16,18型。结果男女性均可感染HPV6,11和HPV16,18型,男性感染者以HPV6,11型为主,感染率为27.68%(157/567)。女性1000人次中,确诊感染HPV有659人,HPV阳性320人次,检出率为32%,其中低危型208例,即HPV6,11型阳性率为31.56%;高危型112例,即HPV16,18型为16.99%。结论FQ-PCR具有灵敏度高、特异性强、简捷方便的特点,适于临床推广应用。HPV DNA分型检测技术可以快速区分高危型及低危型HPV感染,有助于对尖锐湿疣的复发和宫颈癌变作出可能性预测。