实时荧光定量聚合酶链反应突触后密度蛋白93基因TaqMan探针的制备

目的:制备实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)突触后密度蛋白93(PSD93)基因TaqM an探针以进一步研究PSD93表达情况。方法:采用RT-PCR法,从生后1天的SD大鼠大脑组织mRNA中扩增PSD93基因部分CDS区片段,克隆入T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定及序列测定,采用TaqM an探针,以重组质粒为模板绘制标准曲线。结果:RT-PCR法扩增出一特异产物与预期长度113bp相符,DNA序列测序的结果与GenBank提供的已知序列(RNU50717)比较,所克隆的PSD93基因片段与其中的113bp完全相同,与PSD93基因100%同源。以重组质粒为模板绘制标准曲线,相关系数r大于0.99,反应效率为0.95,各点变异系数小于20%。结论:采用RT-PCR和T载体技术成功获得FQ-PCR PSD93基因TaqM an探针。

TaqMan-MGB探针荧光定量聚合酶链式反应法检测酸奶制品中动物双歧杆菌BB-12

目的建立一种TaqMan-小沟结合物(minor groove binder,MGB)探针荧光定量聚合酶链式反应法检测酸奶制品中动物双歧杆菌BB-12的分析方法。方法设计动物双歧杆菌BB-12的16SrRNA序列的MGB探针,利用荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术,构建目标序列的过表达载体,提取质粒进行标准曲线的绘制,最后进行市售酸奶样品检测,定量酸奶中BB-12菌株的数量。结果所有载体标准品均产生显著的荧光增幅,循环阈值(cycle threshold, Ct)介于16~20之间;而以其他酸奶制品添加菌及大肠杆菌样品DNA为模板则无荧光扩增信号。在检测灵敏度方面,BB-12载体可被稳定检出的质量浓度低至0.0000584 ng/μL, Ct值平均数为28.73,即检测灵敏度低至为0.05 pg。绘制的标准曲线线性良好,扩增效率E为0.39,判定系数R^(2)=0.9999。市售酸奶样品检测特异性好、灵敏度高、定量结果准确。结论本研究建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测法可实现在酸奶中对BB-12菌种的检测及定量。

间日疟原虫荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

目的 建立间日疟原虫荧光定量聚合酶链式反应 (FQ -PCR)检测方法 ,为快速、准确定量检测间日疟原虫奠定基础。方法 根据间日疟原虫SSURNA基因序列 ,设计并合成引物和荧光标记探针 ,将PCR扩增的间日疟原虫SSURNA基因片段克隆入载体 ,对重组质粒进行筛选、鉴定后 ,作为阳性模板 ,用于标准曲线的判定和样品检测。结果 应用重组质粒制作的定量曲线 ,循环阈值与模板浓度具有良好的线形关系 ,12 7份疟区血样和 30份正常血样的检测 ,显示此法有较高的灵敏度和特异度 ,定量检测结果与镜检感染率呈直线相关 ,相关系数为 0 95 9。

实时荧光定量聚合酶链反应原理和在预防兽医学中的应用及研究进展

聚合酶链反应（PCR）是检测核酸的强力方法。由于PCR技术简便易行、灵敏度高等优点，该技术被广泛应用于基础研究．成为分子生物学必不可少的研究工具。由于传统的PCR技术存在不能准确定量．且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点．使其应用受到局限。对PCR产物进行准确定量成为PCR技术发展的重要方向。

荧光定量聚合酶链反应技术检测痰结核分枝杆菌DNA及其临床应用研究

目的探讨荧光定量聚合酶链反应(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)技术在肺结核诊断中的临床价值。方法对144例活动性肺结核的痰及30例健康对照者的痰进行 FQ-PCR 检测,并与痰涂片检查法、改良罗氏培养法结果进行比较。结果 FQ-PCR 检测痰结核分枝杆菌阳性率、痰涂片抗酸检查法阳性率、改良罗氏培养法阳性率分别为61.1%(88/144)、51.4%(74/144)、55.6%(80/144),以 FQ-PCR 检测痰结核分枝杆菌阳性率为最高,FQ-PCR 检测特异性为100%。结论 FQ-PCR 技术检测痰结核分枝杆菌具有较高的敏感性和特异性,该方法快速、准确,对肺结核的诊断有一定价值。

荧光定量聚合酶链反应在巨细胞病毒感染检测中的应用

目的 为了探讨巨细胞病毒检测的新途径及FQ -PCR技术在巨细胞病毒DNA诊断中的实用价值。方法 运用FQ-PCR技术对 10 0例怀疑巨细胞病毒感染的患者进行DNA测定 ,并与微粒子发光法定量检测抗 -CMV及金标免疫斑点法检测抗 -CMV进行比较。结果 FQ -PCR技术阳性率为 90 % ,微粒子发光法阳性率 86 % ,金标法阳性率为 6 2 %。结论 FQ -PCR技术不但具有明显高于微粒子发光法及金标法的阳性率 ,而且具有准确定量分析的优点 ,为病人早期诊断与药物疗效观察提供了更为精确的病原学依据 。

荧光定量聚合酶链反应检测血清中HBV-DNA

目的 :研究荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)检测HBV DNA对辨别病毒复制的临床意义。方法 :采用FQ PCR和ELISA方法 ,检测 79例患者血清HBV DNA拷贝数和免疫学血清指标。结果 :2 6例HBsAg、HBeAg、抗 HBc均阳性的标本 ,HBV DNA也全部阳性 ,平均拷贝数为 2 .7× 10 5/mL。 8例HBsAg、HBeAg阳性的标本 ,HBV DNA也全部阳性 ,平均拷贝数为5 .2× 10 4/mL。 2 1例HBsAg、抗 HBe、抗 HBc均阳性的标本HBV DNA阳性率为 6 6 .7% ,平均拷贝数为 3.1× 10 4/mL。 9例HBsAg阳性的标本HBV DNA阳性率为 11%。平均拷贝数为1.4× 10 3 /mL。结论 :荧光定量聚合酶链反应检测HBV DNA可以更加准确地判断HBV的感染和复制情况。

荧光定量聚合酶链反应检测沙眼衣原体

沙眼是一种由沙眼衣原体引起的常见病,多发病.目前由于抗生素的应用,临床表现多不典型,易漏诊误诊.

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

实时荧光定量聚合酶链反应技术及其在医学生物监测中的应用

传统聚合酶链反应（PCR）技术在应用中，由于PCR产物需经过琼脂糖凝胶电泳和紫外线检测．产物易污染造成假阳性，且只能做到定性检测。近年来出现的核酸定量PCR技术，尤其是实时荧光定量PCR（real—time fluorescent quantitative PCR，FQ—PCR）技术，实现了PCR由定性到定量的飞跃。FQ—PCR技术是在PCR定性技术基础上发展起来的一种核酸定量和分析技术，该技术融汇了PCR的高灵敏性、DNA杂交技术的高特异性和光谱技术的高精确定量优点，且操作简便、污染少，已成为分子生物学等许多研究及应用科学中的重要工具．

Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应标准品的制备及应用研究

目的:制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准品。方法:提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。结果:重组质粒经PCR扩增及序列测定表明,pGMT/Satb2基因已成功克隆。结论:所构建的pGMT/Satb2基因实时荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此法可作为实时荧光定量PCR检测Satb2基因的标准方法。

实时荧光聚合酶链反应检测视神经损伤后NgR mRNA表达的变化

目的:定量检测成年大鼠视神经损伤后NgRmR-NA表达的变化情况,探讨Nogo-A和NgR在视神经损伤后的表达变化间的关系。方法:采用荧光定量PCR(FluoresenceQuantivepolymerasechainreaction,FQ-PCR)法,定量分析视神经损伤后1,3,5,7,15d视神经NgRmRNA表达的变化。结果:大鼠视神经钳夹伤后其NgRmRNA表达无显著变化。结论:Nogo-A和其受体NgR表达变化的不一致,提示了Nogo-A除了抑制再生外,可能还有其它尚未阐明的功能。

荧光定量PCR及酶联免疫吸附试验检测HBV方法比较

目的探讨荧光定量PCR（FQ-PCR）与酶联免疫吸附试验（ELISA）检测乙型肝炎病毒（HBV）的区别,并分析其临床应用价值。方法选取2015年8-12月在该院就诊的221例疑似乙型肝炎患者的血清标本,分别使用FQ-PCR及ELISA法对HBV进行检测,探讨FQ-PCR的检测方法、阳性率及临床意义。结果 FQ-PCR检测共检出134例阳性标本,阳性率为60.63%;ELLSA检测乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎e抗原、乙型肝炎核心抗体、乙型肝炎e抗体和乙型肝炎表面抗体阳性率（36.20%、6.33%、33.48%、15.32%、43.90%）均低于FQ-PCR对HBV-DNA检出的阳性率（60.63%）,且分别与大三阳组和小三阳组比较,差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论 FQ-PCR能够直观地反映HBV在肝细胞内的复制情况,适合早期诊断并指导临床用药,其诊断和指导意义高于ELISA法,且操作快速简便,值得临床推广。

聚合酶链反应技术应用进展

全血不需分离细胞 ,将红细胞低渗溶解 ,直接取细胞胞溶物进行PCR基因分型 ,结果可靠 ;血管紧张素转换酶 (ACE)等位基因缺失在缺血性心肌病中有重要意义 ,而ACE基因插入 /缺失 (I/D)多态性检测由FerencSomogyVari提出的迅速PCR ,在Lightcycler仪器上采用荧光标记的寡核苷酸杂交探针能准确快速的进行基因分型 ;DNA模板无需变性 ,进行HBVDNA扩增。

荧光探针定量PCR在检测HBV-DNA的应用

目的 用荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)方法准确地定量检测血清中的HBV DNA数量和免疫指标 ,以指导临床。方法 用FQ PCR方法和酶联免疫吸附试验 (ELISA)方法分别检测 184份临床血清标本的HBVDNA和免疫指标。结果 用 (ELISA)作对照 ,经FQ PCR检测 ,HBeAg(+)组 (82份 )的阳性率为 10 0 % ,HBV DNA阳性拷贝数范围在 10 5～ 10 10 /ml;HBeAb(+)组 (5 2份 )的阳性率为 5 5 8% ,HBV DNA阳性拷贝数范围在 10 4～ 10 7/ml;HBsAb(+)组 (2 0份 )的阳性率为 15 % ,HBV DNA阳性拷贝数范围在 10 4～ 10 5/ml;对照组 (30份 )的阳性率为 0。HBeAg(+)组血清中HBV DNA含量 (10 7 2± 1 13 )显著高于HBeAb(+)组 (10 5 8± 1 4)和HBsAb(+)组 (10 4 67± 0 58)。结论 FQ PCR检测HBV DNA具有较高的灵敏度和特异性 ,且能准确定量 ,FQ PCR可以检测HBV的真实感染和复制情况 ,对乙型肝炎临床诊断 ,治疗及疗后观察有重要意义。