DNA-PKcs表达与鼻咽癌细胞株放射敏感性的关系

目的探讨不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE-1(鼻咽高分化鳞癌细胞株)和CNE-2(鼻咽低分化鳞癌细胞株)中DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)的催化亚基DNA-PKcs基因的表达与鼻咽癌细胞放射敏感性的关系。方法通过克隆形成实验测定CNE-1、CNE-2不同剂量的存活分数,并用线性二次模型拟合剂量存活曲线求出放射生物学参数α、β、SF2、MID值,以及四氮唑蓝比色分析法(MTT法)检测60Co-γ线4Gy照射后12h细胞的存活率,以评价两株细胞的放射敏感性。逆转录实时荧光定量PCR技术(RT-FQ-PCR)检测照射前、后不同时间及不同剂量CNE-1、CNE-2细胞mRNA水平DNA-PKcs基因的定量表达。结果CNE-1在各个剂量点的存活分数均比CNE-2高,MID值分别为2.78、1.61,SF2值分别为0.627、0.341;4Gy照射后12h的存活率分别为88.2%、72.3%;RT-FQ-PCR显示两株细胞中均有DNA-PKcs基因的表达,其相对表达量之比为7.54±2.71(t=4.17,P=0.014),表达差异有统计学意义,DNA-PKcs基因在CNE-2细胞中存在时间、剂量依赖关系。结论实验验证了CNE-2比CNE-1对射线更敏感,DNA-PKcs基因的表达与鼻咽癌细胞的放射敏感性有关。

溶血对检测不同含量乙肝病毒DNA干扰作用的研究

目的研究不同程度的溶血对荧光定量PCR检测不同含量的HBVDNA的干扰作用。方法采用PEG沉淀法和直接煮沸法提取血清中HBVDNA，用荧光定量PCR方法研究不同程度的溶血对检测不同含量HBVDNA的干扰作用。结果采用沉淀法提取HBVDNA，重度溶血明显抑制低拷贝组至高拷贝组HBVDNA的扩增；中度溶血使低拷贝组至中拷贝组的HBVDNA含量明显降低；轻度溶血降低了低拷贝组的HBVDNA含量。采用直接煮沸法提取HBVDNA，重度及中度溶血均明显抑制低拷贝组至高拷贝组HBVDNA的扩增；对低拷贝10^3组的抑制最显著，完全抑制其HBVDNA的扩增。轻度溶血使低拷贝组至中拷贝组的HBVDNA含量明显下降。结论重度溶血对低拷贝组到高拷贝组的HBVDNA的荧光定量检测均有明显的抑制作用，对于重度溶血标本，临床应重新留样检测HBVDNA，轻度溶血主要影响低拷贝组HBVDNA的检测结果，对低拷贝的轻度溶血样本，临床应重新留样检测，对高拷贝的轻度溶血样本，可以不重新留样。溶血对直接煮沸法的影响比沉淀法更大。

两种HBV-DNA定量测定方法的比较

目的考察实时荧光PCR定量法(FQ-PCR)检测乙型肝炎病毒DNA的准确性。方法通过对 56份血清进行HBV—DNA检测,其中包括一个10倍倍比稀释系列6份、阴性血清12份和阳性血清38份。比较两种方法的准确性及临床标本符合情况。结果微板核酸杂交定量法和实时荧光定量法的线性回归系统分别为0．977 和0．999。实时荧光定量法所检测的不同含量的样本批内变异系数均低于微板核酸杂交定量法。结论实时荧光定量法具有较好的灵敏度、特异性、重复性和线性,与微板核酸杂交定量法有良好的相关性。

LAMP与FQ-PCR技术检测HBV DNA的特异性和灵敏度比较

目的采用环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术与实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)技术检测HBV DNA,并对LAMP方法的反应条件进行优化,比较两种方法检测HBV DNA的灵敏度及特异性。方法选取经医院确诊的乙肝患者的血清,提取血清中的HBV DNA作为扩增模板,同时对LAMP方法的各种条件进行优化,并分别采用LAMP和FQ-PCR两种方法对同一HBV DNA模板做10倍梯度稀释的标本进行HBV DNA的检测,比较其灵敏度;分别用两种方法对乳头瘤病毒(HPV)、EB病毒、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及正常人血清基因组DNA在相同条件下进行实验,观察两种方法在检测中是否出现假阳性结果,以确定两种方法的特异性。结果对同一HBV DNA模板进行10倍梯度稀释后,FQ-PCR技术在待测血清标本(2.38×107 copy/mL)被稀释到10-5,就难以进行准确检测,而LAMP方法在待测血清标本被稀释到10-7时,仍能获得较好的扩增结果;对HPV、EB病毒、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及正常人血清基因组DNA进行LAMP和FQ-PCR检测,结果均为阴性。结论采用LAMP方法可以成功、快速、高效、特异地扩增HBV DNA,与FQ-PCR方法比较,都能特异地检测HBV DNA,但LAMP方法具有更高的灵敏性,操作更为简单、方便,且不需要昂贵的仪器,更适合基层检测机构推广使用。

荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒的临床研究

目的 :建立荧光定量PCR检测HBV DNA的方法 ,探讨荧光定量PCR在乙型肝炎病毒检测方面的临床价值。方法 :采用荧光定量PCR技术 ,对不同类型乙型肝炎患者及无症状健康者血清HBV DNA进行定量检测。对30例慢性乙型肝炎拉米夫啶治疗前后血清HBV DNA含量进行定量监测。结果 :(1)血清HBV DNA的检出率与HBeAg阳性率呈正相关 ,无症状健康者仍有 3%的检出率。 (2 )慢性乙型肝炎和乙肝后肝硬化的血清HBV DNA含量明显高于无症状HBV感染者和急性乙型肝炎 (P <0 .0 1)。 (3) 30例慢性乙型肝炎 ,经拉米夫啶治疗 12个月 ,HBV DNA阴转率为 73.3% (2 2 / 30 ) ,明显高于HBeAg阴转率 (46 .2 % ) (P <0 .0 5 )。结论 :荧光定量PCR检测HBV DNA ,能直接反映血清HBV DNA含量 ,在判断体内HBV是否复制、复制的程度 ,HBV是否被清除以及HBV血清标志阴性肝炎的诊断等方面明显优于HBV血清标志物检测。荧光定量PCR检测HBV DNA是抗病毒治疗选择和考核抗病毒疗效的最直接最可靠的指标 ,具有重要的临床价值 。

乙型肝炎患者免疫学标志与其病毒DNA表达的相关性

目的探讨乙型肝炎病毒感染的免疫学标志（HBVM）与乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（HBVDNA）的相关性。方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和荧光定量聚合酶链反应（FO-PCR）技术分别对1573例乙型肝炎（下称乙肝）患者血清进行HBVM（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc）及HBVDNA检测。结果HBsAg（＋）、HBeAg（＋）、抗-HBc（＋）模式，HBVDNA≥10^3copy／ml检测率高达91．84％，其余HBsAg（＋）、抗-HBe（＋）、抗-HBc（＋）为58．13％，抗-HBe（＋）、抗-HBc（＋）模式为33．33％，抗-HBs（＋）、抗-HBe（4-）、抗-HBc（＋）为16．28％，抗～HBs（＋）模式为10．53％及HBVM全部阴性模式10．00％，并对HBVM各种模式HBVDNA表达的频率分布进行分析，结果显示HBsAg（＋）、HBeAg（＋）、抗-HBc（＋）模式，HBVDNA拷贝值由低（≥10^3 copy／ml）向高（10^8 eopy／ml），且50．20％乙肝患者在10^7～10^8copy／ml范围内。HBVM其余模式，多数患者集中在较低拷贝值范围内（10^3copy／ml）。分别是HBsAg（＋）、抗-HBe（＋）、抗-HBc（＋）为71．4％，抗-HBs（＋）、抗-HBe（＋）、抗-HBe（＋）为42．86％，抗-HBe（＋）、抗-HBe（＋）为66．70％。结论血清HBVM阳性患者中72．38％血清HBVDNA≥10^3eopy／ml，且HBsAg（＋）、HBeAg（＋）、抗-HBe（＋）模式的血清中HBVDNA≥10^3 copy／ml检出率及HBVDNA的拷贝值均明显大于其他各种模式（P〈0．05），病毒复制活跃，传染力强，但其余模式仍可能存在病毒复制。

FQ-PCR测定HBV DNA与ELISA检测HBV-M相关性分析

目的探讨HBV DNA含量与HBsAg S/CO值之间的相关性。方法分别用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测100例乙肝患者的HBV DNA含量和乙肝两对半,并记录HBsAg S/CO值。结果100例乙肝患者HBV DNA含量对数值为(4.28±1.89),HBsAg S/CO值为(15.09±6.64),两指标间作相关性分析,r=-0.0156,P>0.05,无相关性。结论HBV DNA是判断乙肝病毒复制的较准确、较直接的抗乙肝病毒疗效观察指标,而HBsAgS/CO值的高低与疾病的严重程度及疗效无关。

PCR-ELISA法及荧光定量PCR法检测HBV感染者精液HBV-DNA的探讨

目的探讨PCR-ELISA法及荧光定量PCR法(FQ-PCR)检测HBV感染者精液中HBV-DNA检出情况及其临床意义。方法选取男性HBV感染者60例,采集患者精液、静脉血,用PCR-ELISA法来检测患者精液及血清中HBV-DNA。同时采用荧光定量PCR检测患者精液中HBV-DNA。结果PCR-ELISA法:60例精液标本HBVDNA阳性12例,阳性率18.33%,拷贝数为1.267×103-6.532×105/ml,平均拷贝数为4.781×104/ml;60例血清标本阳性53例,阳性率为88.33%,拷贝数1.462×103-5.153×107/ml,平均拷贝数为2.451×106/ml。荧光定量PCR法:60例精液标本HBVDNA阳性13例,阳性率21.67%,拷贝数为1.357×103-7.113×105/ml,平均拷贝数为4.983×104/ml;两种检验方法检测精液HBV-DNA的阳性检出率比较无显著性意义(P>0.05)。结论PCR-ELISA法与荧光定量PCR定量检测精液中HBVDNA同样具有较强的特异性和灵敏度,为临床了解乙型肝炎患者精液中肝炎病毒的感染状态提供了帮助,具有重要的临床意义。

外周血淋巴细胞中EB病毒载量与鼻咽癌诊断及分期的关系

目的探讨外周血淋巴细胞中EB病毒载量与鼻咽癌诊断、分期及预后的价值。方法采用实时荧光定量基因扩增技术,抽取鼻咽癌患者静脉血2mL,用EDTA-Na2抗凝,用淋巴细胞分离液分离血中淋巴细胞,再用DNA提取液提取淋巴细胞中的EBV-DNA为模板进行扩增检测。结果47例鼻咽癌患者中E-BV-DNA阳性率为63.8%(30/47),对照组61例非鼻咽癌患者中EBV-DNA的阳性率为11.5%(7/61),两者差异有显著性(χ2=32.30,P<0.01)。早期(Ⅰ、Ⅱ期)14例与晚期(Ⅲ、Ⅳ期)16例鼻咽癌患者EBV-DNA含量比较差异有显著性(t=4.65,P<0.01),晚期患者淋巴细胞中EBV-DNA含量明显高于早期患者。结论定量检测外周血淋巴细胞中EBV-DNA对鼻咽癌的诊断、分期和预后有极高参考价值,可做为监测病情及判断疗效的一种有效手段。

乙型肝炎病毒DNA定量与ALT的相关分析

目的探讨HBsAg+、HBeAg+、HBcAb+(简称"大三阳)"及HBsAg+、HBeAb+、HBcAb+(简称"小三阳)"乙型肝炎(简称"乙肝)"患者病毒DNA(HBV DNA)与ALT的相互关系。方法选择1191份乙肝患者血清标本(其中大三阳192例,小三阳999例),HBV DNA测定采用FQ PCR法,ALT检测采用酶法,对其检测结果进行分析。结果大三阳组和小三阳组HBV DNA与ALT值的差异均有高度统计学意义(P<0.01)。大三阳组HBV DNA异常率(91.67%)和ALT异常率(60.42%)显著高于小三阳组(21.62%、28.13%)(P<0.01),但HBV DNA与ALT并无相关性。结论大三阳患者HBV DNA含量及肝损伤程度高于小三阳患者,但HBV DNA与ALT并不相关,HBV DNA与ALT两者同时测定有助于更明确地反映患者体内病毒的感染情况。

乙型肝炎病毒感染者HBV DNA与血清病毒标志物的关系

目的 探讨乙型肝炎病毒 (HBV)感染者HBVDNA检出情况及其与血清病毒标志物的关系。方法 采用实时荧光定量PCR(FQ PCR)检测 2 0 0份HBV感染者血清中HBVDNA含量 ,同时用全自动免疫分析仪检测HBV 5项血清标志物。结果 2 0 0份血清中 ,乙型肝炎病毒标志物不同组合组的HBVDNA阳性率有差异 ,HBsAg、HBeAg和 (或 )HBcAb阳性组阳性率约为 98.1% ,其中 96 %以上HBVDNA≥ 10 4copy/ml;HBsAg、HBcAb和 (或 )HBeAb阳性组HBVDNA阳性率约为 76 .5 % ,但其中 90 %以上HBVDNA≤ 10 4copy/ml;单纯HBV抗体阳性组HBVDNA阳性率约为13.0 % ,但均为HBVDNA≤ 10 3 copy/ml。三组间HBVDNA阳性率及分布均有明显差异 (P <0 .0 5 )。而且HBVDNA含量与疾病严重程度相关。结论 FQ

荧光定量检测HBV DNA与乙肝两对半结果对比分析研究

目的 为了对乙肝患者体内 HBV复制及传染性有更直接地了解 ,亦更有利于对临床 HBV感染的诊断、治疗方案的选择及疗效判定。方法 运用荧光定量 PCR(FQ- PCR)和 EL ISA两种方法同时检测了 310份肝炎患者血清 ,并对结果进行了对比分析。结果 乙肝大三阳患者血清 HBV DNA检出率为 92 .5 % (74/ 80 ) ,平均拷贝数为 4.10× 10 1 0 /ml;小三阳患者血清 HBV DNA检出率为 32 .35 % (2 2 / 6 8) ,平均拷贝数为 1.31× 10 9/ ml;HBs Ag(+ )、HBc Ab(+ )组血清 HBV DNA检出率为 45 .71% (32 / 70 ) ,平均考贝数为 4.0 8× 10 8ml;HBV- M全阴性组血清 HBV DNA检出率仍达6 .6 7% (2 / 32 ) ,平均拷贝数仍达 1.5 4× 10 8/ ml。结论 HBV- M阴性患者仍有 HBV DNA阳性者 ,因此对临床 HBV感染、复制及传染性的判断以及指导治疗 ,除乙肝二对半标志物 EL ISA检测外 ,加做 HBV DNA FQ- PCR检测同样具有重要意义。

乙型肝炎血清标志物与HBV DNA的相关性分析

目的探讨乙型肝炎患者血清标志物(HBV-M)与HBV-DNA的关系。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量-PCR(FQ-PCR)法对1433例乙肝患者进行HBV-M以及HBV-DNA定量检测。结果在HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)血清中HBV-DNA阳性率和含量最高,血清中HBeAg与HBV-DNA含量密切相关,但部分HBeAg阴性或HBeAb阳性患者也有较高的HBV-DNA阳性率及含量。结论单凭血清免疫标志物模式难以准确判断HBV的复制程度及传染性的强弱,定量检测HBV-DNA能真实反映HBV的复制情况,对诊断、治疗乙肝患者及疗效观察具有较大的指导意义。

乙型肝炎病毒DNA定量分析的临床意义

目的:探讨乙型肝炎病毒HBV DNA含量与血清标记物的相关性及其对乙型肝炎诊断、预后的意义。方法:采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测1652例乙肝患者血清学标记物(HBV—M),其血清学模型包括以下9种组合;并选取160例HBV M全阴性正常人作为对照。实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测血清中HBV DNA含量。结果:1、2组HBV DNA阳性率为98.4%和96.67%,明显高于其它组。结论:HBV DNA含量与乙肝病毒e抗原具有显著相关性,HBV M和HBV DNA定量检测对于临床乙肝病毒感染、复制及临床治疗有重要意义。

HBVpreS_1-Ag、HBVpreS_2-Ag、HBV-DNA、HBVM的相关性分析及其意义

探讨HBV感染者血清中HBVM、HBV -DNA、HBVpreS1-Ag及HBVpreS2 -Ag的相关性及其意义。采用ELISA法检测HBVM、HBVpreS1抗原和HBVpreS2 抗原 ,FQ -PCR定量检测HBV -DNA。HBeAg与HBVpreS1抗原、HBVpreS2 抗原、HBV -DNA在HBV感染者血清中具有良好的平行关系 ,其阴 /阳性符合率均高于 73 1%。HBV -DNA、HBVpreS1抗原、HBVpreS2 抗原之间均无显著性差异 (P >0 0 5 )。HBeAg、HBV -DNA、HBVpreS1抗原、HBVpreS2抗原之间高度相关。HBVpreS1抗原和HBVpreS2 抗原较HBeAg敏感。应用HBVpreS1抗原、HBVpreS2 抗原、HBV -DNA及HBVM同时进行联合检测 ,对HBV感染的早期诊断 ,了解HBV复制、转归 ,更确切地掌握病情的发生。

乙肝HBV DNA荧光定量检测与血清标志物结果相关性分析

目的研究乙肝血清学标志物(HBV-M)结果与HBV-DNA水平的关系,分析HBV DNA阳性率在各年龄组的分布情况。方法对深圳市部分服务行业人员血清应用荧光定量PCR检测和ELISA法检测并对结果进行分析。结果1 781例乙肝血清学标志物阳性血清中有1 102例HBV-DNA阳性。其中883例1.3.5阳性(俗称“大三阳”)血清中HBV-DNA的阳性率为96.15%;722例1.4.5阳性(俗称“小三阳”)血清中HBV-DNA的阳性率为24.38%;138例1.5阳性血清中HBV-DNA的阳性率为38.41%;22例1.3阳性血清中HBV-DNA的阳性率为90.91%;11例HBsAg阳性血清中HBV-DNA阳性率为36.36%。结论两种方法检测乙肝标志物有密切的相关性。荧光定量PCR是检测HBV-DNA含量较精确的方法,能正确反映乙肝病毒的复制水平和活跃程度;HBsAg和HBeAg与HBV-DNA含量有着明显的相关关系。

HBV-DNA荧光定量PCR检测下限的确立

目的确立本实验室荧光定量PCR检测HBV-DNA项目的检测下限。方法分别测定原倍HBV-DNA质控血清及经100、200倍稀释后HBV-DNA含量。结果原倍质控血清测定结果的均值为3.63×104 IU/mL(4.56),在给定靶值范围2.14×104～2.14×105 IU/mL(4.33～5.33)的低值附近;100倍稀释后的检测结果的均值为3.32×102 IU/mL(2.52),在试剂盒最低检测下限(500 IU/mL)以下,且100份标本能100%定量检测。结论本实验室设备及所用的试剂、方法对HBV-DNA>500 IU/mL的标本完全有能力定量检测;检测下限为500 IU/mL是符合要求的。

全血标本冷藏保存一周对血清HBV DNA复测结果的影响

目的探讨全血标本冷藏保存1周对血清乙肝病毒DNA（HBV DNA）复检结果的影响。方法采集乙肝患者外周全血150例,及时2~8℃保存,分别于采血后第1天和第7天用实时荧光定量PCR法（FQ-PCR）检测血清HBV DNA水平。结果150例全血标本第1天、第7天时血清HBV DNA载量分别为：5.50±1.46、5.64±1.53,结果呈小幅升高趋势,但两组差异无统计学意义（P〉0.05）;以第1天结果为基准,第7天时结果偏倚绝对值为（4.26±0.03）%,其中15例偏倚大于±7.5%。结论以分析中质量控制为前提,全血标本冷藏保存1周对血清HBV DNA复测结果的影响符合ISO 15189室内质控要求,能满足临床追加检测或复查申请;操作误差和FQ-PCR方法学的不足仍是造成复测较大偏差的最主要原因。

人工肝支持系统治疗前后HBV DNA水平的变化

目的探讨重型乙型病毒性肝炎HBVDNA的复制情况及其在人工肝支持系统治疗中的变化。方法采用荧光定量PCR方法检测重型乙型病毒性肝炎患者人工肝前后HBVDNA水平。结果人工肝治疗前后病人血清HBVDNA定量(log值)分别为(6.20±0.53),(5.33±0.47)(=36,<0.01);治疗后血清总胆红素、直接胆红素、总胆汁酸、丙氨酸转氨酶等明显下降(=78,<0.01),凝血酶原时间明显缩短(=78,<0.01)。结论人工肝支持系统治疗可降低重型乙型病毒性肝炎HBVDNA水平并能明显改善其肝功能。

乙型肝炎患者外周血单个核细胞中乙型肝炎病毒核酸定量检测

目的 探讨乙肝患者外周血单个核细胞 (PBMCs)中HBVDNA定量检测及其临床意义。方法 用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 ,细胞计数并提取单个核细胞及相应血浆中HBVDNA ,用荧光实时定量PCR法检测单个核细胞和血浆中HBVDNA含量。结果 对 188例乙型肝炎患者的外周血单个核细胞和相应血浆中HBVDNA定量检测 ,结果发现 :①外周血单个核细胞HBVDNA检出率为 80 3% ,血浆中HBVDNA检出率为 72 9% ,两者检出率无差异 (χ2 =3 13,P >0 0 5 ) ,检出结果具有一致性 (χ2 =8 2 5 2 ,P <0 0 1)。②在HBV血清学标志为HBsAg(+)HBeAg(+)到HBsAg(+)HBcAb(+)各组中 ,其血浆和PBMCs中HBVDNA检出率和含量均逐渐降低 ,各组中血浆和PBMCs中HB VDNA含量间具有相关性 (P <0 0 5 )。③在不同类型乙型肝炎患者中 ,除 18例急性肝炎患者的血浆和PBMCs中均检出HBVDNA并含量较高外 ,在其余的病例中 ,随着病情严重 ,PBMCs中的检出率明显升高而血浆中的检出率明显降低 ;而除急性肝炎组PBMCs和血浆中HBVDNA含量不具有相关性外 (P >0 0 5 ) ,其它各组间均具有相关性 (P <0 0 5 )。结论 PBMC中的HBVDNA持续存在在乙肝患者的发病机制起着重要作用 。