应用激光扫描共聚焦显微镜FRAP技术研究兔早期胚胎发育中细胞间隙连接介导通讯

本研究应用激光扫描共聚焦显微镜的光漂白恢复技术(FRAP)分析兔早期胚胎卵裂球之间通过间隙连接介导的细胞通讯(GJIC)。研究结果发现,用强激光分别将4-细胞期胚胎、异裂胚胎和8-细胞期胚胎的一个卵裂球荧光光漂白后,经过15分钟的荧光恢复,4-细胞期胚胎的光漂白恢复率为17.8％,异裂胚胎的光漂白恢复率为23.7％,二者之间没有明显的差异;8-细胞期胚胎的光漂白恢复率为78.2％,与前二者之间存在明显的差异。推测兔早期胚胎卵裂球细胞间隙连接建立的时间在8-细胞阶段,胚胎卵裂球间隙连接通讯可能是兔胚胎正常发育的重要条件。

基于荧光漂白恢复技术检测乳脂肪球膜上生物分子的流动性

为了推动乳制品的精准评价,采用高分辨率激光共聚焦显微镜(CLSM)结合多荧光探针技术观察乳脂肪球的微观结构,并利用荧光漂白恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)定量检测母乳、牛乳、羊乳中乳脂肪球膜上生物分子的流动性。结果表明:3种乳的微观结构基本一致,均出现了新月区,证明了新月区是局部磷脂富集区;乳脂肪球中甘油三酯和水溶性蛋白质的动态分子比例较高,极性脂质和磷脂酰胆碱的动态分子比例较为接近,鞘磷脂的动态分子比例最差;牛乳中甘油三酯的流动性慢于母乳和羊乳,母乳中极性脂的流动性最慢。FRAP可以直观地表征乳脂肪球膜上生物分子的流动性,可为乳状液中膜界面的生化特性研究提供新的方法。

5-HT_(1A)受体蛋白在PC12细胞膜转运的动态变化

目的在神经元样PC12活细胞上进行实时、可视和定量研究5-羟色胺1A受体的时空分布、膜转运和信号传导机制。方法运用RT-PCR方法获得小鼠5-HT1A基因,并插入到pEGFP-N1真核表达载体中。采用阳离子脂质体方法将质粒转染至PC12细胞和HEK293细胞中,通过G418筛选出稳定表达5-HT1A-EGFP的PC12细胞系。运用激光共聚焦成像系统观察活细胞中5-HT1A-EGFP的表达情况,利用光漂白荧光恢复(FRAP)技术在PC12细胞膜局部漂白后观察5-HT1A-EGFP荧光蛋白在细胞膜上转运的情况。结果克隆所获得的小鼠5-HT1A基因是准确的。5-HT1A-EGFP蛋白清晰的分布于PC12和HKE293细胞膜上。通过FRAP技术观察到漂白区域的细胞膜在100s内有部分恢复,说明受体在细胞膜上发生转运。结论建立了稳定表达5-HT1A-EGFP融合蛋白的PC12细胞系,并利用活细胞成像和FRAP技术观察分析并证实了5-HT1A受体在PC12细胞的膜表面的表达和转运的动态变化。

二氧化硅刺激肺成纤维细胞间隙连接功能下调的研究

目的 探索矽肺发病过程中二氧化硅 (SiO2 )刺激肺纤维化发生与肺成纤维细胞间隙连接通讯功能 (GJIC)下调的关系。方法 不同剂量的SiO2 刺激SD大鼠肺泡巨噬细胞 (PAM)及具有肺泡巨噬细胞特性的、经 12 O 四葵酰基 佛波 13 乙酸酯 (佛波酯 ,PMA或TPA)诱导分化的人血单核细胞株(pTHP 1)培养上清液 ,作用于中国仓鼠肺成纤维 (CHL)细胞。用四唑盐 (MTT)法测定CHL细胞增殖(A570nm) ;用激光扫描共聚焦显微镜 ,按荧光光漂白后再恢复 (FRAP)技术测定CHL细胞GJIC功能 [荧光传递速率K ,(× 10 -3/s) ]。结果 SiO2 刺激的PAM上清液和pTHP 1上清液均能诱导CHL细胞增殖(PAM :F =3.2 0 5 ,P <0 .0 5 ;pTHP 1:F =13.779,P <0 .0 1)及抑制GJIC功能 (PAM :F =19.948,P <0 .0 1;pTHP 1:F =9.36 5 ,P <0 .0 1) ,并随SiO2 浓度增加 (5 0、10 0、2 0 0和 5 0 0 μg/ml) ,细胞增殖能力渐强 ,呈剂量-效应关系 (PAM :r=- 0 .80 3,P <0 .0 5 ;pTHP 1:r =- 0 .914,P <0 .0 1)。PAM和pTHP 1细胞上清液可以增强CHL细胞的GJIC功能 (K均数分别为 2 1.2 4× 10 -3/s、18.92× 10 -3/s)和抑制细胞增殖 (A570nm均数分别为 0 .5 0 6、0 .2 18) ,和空白对照 (7.81× 10 -3/s、7.81× 10 -3/s和 0 .5 39、0 .388)相比 。

SiO_2刺激肺泡上皮细胞间隙连接功能下调的研究

目的 探索矽肺发病过程中 ,SiO2 对肺泡上皮细胞增殖和间隙连接通讯功能 (GJIC)的影响。方法 不同剂量的SiO2 刺激SD大鼠肺泡巨噬细胞 (PAM)培养上清液 ,作用于正常貂肺泡上皮细胞株CCL 6 4细胞。用四唑盐 (MTT)法测定CCL 6 4细胞增殖 (以A570nm值表示 ) ;采用激光扫描共焦显微镜 (LSCM ,LeicaTCSSP)用荧光光漂白后再恢复 (FRAP)技术测定CCL 6 4细胞GJIC功能 [以荧光扩散率K(× 10 -3 /s) ]表示。结果 体积分数为 5 %的SiO2 刺激的PAM上清液能诱导CCL 6 4细胞增殖 (F =9.6 79,P <0 .0 1) ,并抑制CCL 6 4细胞间GJIC功能 (F =2 0 .5 87,P <0 .0 1)。在 5 0～ 5 0 0 μg/mlSiO2 范围内 ,随SiO2 浓度增加 ,两者均呈良好的剂量依赖性关系 (GJIC :r =- 0 .943,P <0 .0 5 ;增殖 :r=0 .891,P <0 .0 5 )。结论 SiO2 刺激PAM培养上清液可以抑制肺泡上皮细胞的GJIC功能 ,并诱导细胞增殖。推论肺泡上皮细胞GJIC功能下调在SiO2 介导的肺泡上皮组织损伤中有重要的作用。