利用荧光共振能量转移技术研究活细胞TLR4与MD-2作用结构域

脂多糖(LPS)的识别和信号转导是宿主发生防御反应的关键,Toll样受体4(TLR4)与髓样分化蛋白-2(MD-2)形成复合物在LPS的识别及其信号转导中发挥了重要作用.研究TLR4与MD-2结合的功能结构域,对于深入了解LPS信号转导机制及其内毒素休克的防治具有重要意义.运用基于强度的三通道荧光共振能量转移技术(FRET)及基因突变和转染技术,研究了活细胞TLR4与MD-2作用的结构域.结果表明:N端Glu24～Met41缺失使TLR4与MD-2结合能力明显下降;LPS刺激后TLR4聚合迅速增加,而缺失Glu24～Met41的TLR4不能聚合.上述结果提示,TLR4的Glu24～Met41不仅是结合MD-2的区域,并且还参与了LPS刺激后TLR4的聚合作用.

角鲨烯对HepG2细胞LDLR表达的影响及机制初探

目的研究角鲨烯对HepG2细胞低密度脂蛋白受体(LDLR)表达的影响,并探讨其降胆固醇的机制。方法MTT法检测不同浓度角鲨烯对HepG2细胞增殖活性的影响;倒置荧光显微镜和流式细胞术检测不同浓度角鲨烯对HepG2细胞内源性LDLR表达活性的影响;FRET技术检测不同浓度角鲨烯对SREBP通路中关键蛋白分子SCAP与Insig2相互作用的影响。结果角鲨烯能明显抑制HepG2细胞增殖活性,且呈浓度依赖性;倒置荧光显微镜和流式细胞术结果均表明,与对照组相比,角鲨烯能增强HepG2细胞LDLR的表达活性;FRET检测结果显示,与模型组相比,角鲨烯组YFP荧光值降低,而在5~25μmol·L^(-1)范围内,随角鲨烯浓度的增高,YFP荧光值降低。结论角鲨烯可能通过抑制SCAP/SREBP信号调控通路中关键蛋白分子SCAP与Insig2的相互作用,上调HepG2细胞LDLR的表达,是具有潜在价值的降胆固醇新药。

基于FRET原理的TEV酶活性检测方法的探索

文章开发了一种基于荧光蛋白的FRET检测技术,探索其在研究TEV蛋白酶活性等方面的应用。在青色荧光蛋白(Cerulean)和黄色荧光蛋白(Citrine)之间插入TEV酶特异性识别位点,构建基于FRET原理的重组底物。在细菌内、外两个体系中,通过酶切前后SDS-PAGE分析及底物荧光强度的变化,对TEV蛋白酶活性的差异进行表征,以此验证该方法的可行性。随着酶含量的增加,基于FRET原理的底物被切割效果明显增强。且在细菌内、细菌外两个体系中,阳性对照均显示出更低的荧光强度。蛋白酶类FRET底物可以在细菌内和细菌外完成对野生型TEV酶及变体的酶活比较,揭示了其在酶活检测以及筛选方面的应用前景,并为进一步开发其他蛋白酶活性检测技术提供了参考和借鉴。

分子与细胞事件的光学可视化——解读2008年诺贝尔化学奖

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)及其突变体作为报告基因,已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物以及药物药效评价和作用机理研究等方面,极大地推动了现代生物学的发展.随着光电信息技术的不断进步,基于荧光报告基因的光学分子成像技术将在细胞、细胞网络、组织、器官和个体等不同层次实现分子与细胞事件的实时可视化,从而在重大疾病的早期诊断和药物研发中发挥重要作用.