利用CRISPR/Cas9技术构建FSTL1基因敲除的SiHa细胞稳定株

目的利用CRISPR/Cas9技术敲除SiHa细胞中的卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)基因,构建FSTL1基因敲除的SiHa细胞稳定株。方法构建sgRNA-FSTL1重组质粒并包装成慢病毒。收集病毒液并感染SiHa细胞,使用嘌呤霉素筛选FSTL1基因敲除的SiHa细胞稳定株;采用RT-qPCR和Westernblot检测SiHa细胞稳定株FSTL1mRNA和蛋白的表达情况。结果FSTL1-sgRNA慢病毒构建成功并筛选出FSTL1基因敲除的SiHa细胞稳定株;FSTL1的mRNA和蛋白表达水平在SiHa细胞稳定株中的表达量均比对照组低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建FSTL1基因敲除的SiHa细胞稳定株。

FSTL1基因促进猪前体脂肪细胞分化成脂的机制

【目的】构建猪FSTL1基因过表达载体和RNAi载体,探究FSTL1基因对猪前体脂肪细胞分化成脂的作用及机制。【方法】通过构建FSTL1基因过表达载体和RNAi载体,在猪前体脂肪细胞中过表达、干扰FSTL1基因并诱导其分化,测定细胞中甘油三酯含量以及脂肪细胞分化相关调节基因的mRNA表达量。【结果】成功克隆得到猪FSTL1基因cDNA序列,其开放阅读框全长924 bp,并将序列提交到GenBank,登录号为KF021281。成功构建猪FSTL1基因的过表达载体pcDNA3.1-FSTL1和RNAi载体pSilencer 4.1-491以及pSilencer 4.1-530。过表达FSTL1基因促进了猪前体脂肪细胞中甘油三酯生成,干扰FSTL1基因抑制了猪前体脂肪细胞中甘油三酯的生成。FSTL1在猪前体脂肪细胞中使PPARγ2和AP2基因表达分别上调了73%和113%,使LPL、Adiponectin和FASN等基因表达分别下调了44%、79%和16%。【结论】FSTL1基因通过上调PPARγ2和AP2基因,下调LPL、Adiponectin及FASN基因的表达,促进猪前体脂肪细胞的分化,提高猪前体脂肪细胞中甘油三酯的含量。

猪FSTL1基因克隆、鉴定及组织mRNA表达水平分析

为了研究猪FSTL1基因,并探明其在猪不同组织中的表达情况和脂肪组织生长发育中的调控作用,试验克隆了猪FSTL1基因,对其生物信息学进行了分析,并采用荧光定量PCR技术检测了其在猪不同组织与脂肪细胞分化时序表达情况。结果表明:猪FSTL1与其他动物氨基酸序列同源性较高,属于亲水性蛋白;FSTL1基因在猪的12个组织中均有表达,其中在肺脏、皮下脂肪组织中的表达量较高;在猪皮下脂肪细胞分化前期表达量短暂增加,随后显著下降。

宫颈癌中卵泡抑素样蛋白过表达对下游基因的影响及生物信息学分析

目的利用基因芯片技术对卵泡抑素样蛋白(FSTL1)下游基因及信号转导通路进行生物信息学分析,探讨FSTL1在宫颈癌中的调控机制。方法采用基因芯片筛选转染FSTL1后HeLa细胞中的差异表达基因;运用生物信息学分析方法寻找FSTL1在宫颈癌中的差异表达基因及调控机制;用反转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)对29个差异表达基因加以验证。结果与阴性对照组相比,实验组中有881个差异表达基因,这些差异表达基因主要富集在转录调控、细胞增殖、凋亡、黏附等生物学过程以及癌症的转录误调节、丝裂源活化的蛋白激酶(MAPK)、P53等信号通路;RTqPCR验证结果显示FSTL1上调PI3K/AKT/Bax/Bcl-2和P53信号相关通路因子,这与基因芯片结果基本符合。结论 FSTL1的差异基因富集于转录调控、细胞增殖、凋亡、黏附等生物学过程,可能通过调控PI3K/AKT/Bax/Bcl-2和P53信号通路来参与宫颈癌的发生发展。