FTA卡保存对虾传染性皮下和造血组织坏死病毒DNA洗脱方法的优化

传染性皮下和造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus,IHHNV)是危害虾类健康养殖的重要病原,为寻找一种快捷保存及分离IHHNV DNA的方法,为后续研究提供完整的核酸材料,选用FTA(flinders technology associates)卡为保存介质,以FTA纯化试剂、TE(Tris-EDTA)缓冲液及去离子水为基础洗脱液,设计7种FTA卡黏附DNA洗脱方法,通过荧光定量PCR检测方法检验不同核酸洗脱分离效果及最低的点膜核酸量。结果显示,于4 mm2的FTA卡上,点样体积为2.5μL,用洗脱液作为模板时,最低点膜核酸浓度需要1.47×104copies/μL以上,可获得最佳的检测灵敏度和100%检出率的洗膜方法为50μL TE缓冲液于95℃下浸洗5 min;用膜片做模板,点膜核酸浓度需要1.82×103copies/μL以上,室温(20~25℃)条件下,用FTA纯化试剂洗脱3次,再用TE缓冲液洗脱2次,洗脱时间均为5 min,可获得最佳的检测灵敏度和100%的准确度。以FTA卡保存对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)、虾十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1,DIV1)、偷死野田村病毒(covert mortality noda virus,CMNV)、致急性肝胰腺坏死副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VpAHPND)核酸,测试所建洗脱方法的效果,证实了该方法对其他虾类病原核酸的洗脱具有通用性。该研究给出了FTA卡保存和洗脱IHHNV DNA的适用性方案,为野外对虾样品采集、病毒核酸样品跨区域传递的保存和运输条件提供了科学数据。

FTA卡和普通定性滤纸提取DNA方法研究

用FTA采样卡和普通定性滤纸采集藏绵羊血样,采用NaOH法提取血液基因组DNA,利用设计的一对引物对DRB1基因第三外显子进行扩增,通过PCR产物琼脂糖凝胶检测,对普通定性滤纸与FTA采样卡的两种提取DNA的方法进行比较,结果认为采用普通定性滤纸-NaOH法提取血液基因组DNA,NaOH的最佳洗涤浓度是25 mmol/L,采用FTA-NaOH法提取血液基因组DNA,NaOH的最佳洗涤浓度是20 mmol/L,但普通定性滤纸法提取血液基因组DNA平均成本远低于FTA采样卡,普通定性滤纸法提取血液基因组DNA具有快速、便捷、经济及高效的特点。

FTA卡在模板DNA制备中的应用研究

目的:本文详细介绍了一种简便、快速、安全的用于DNA制备的方法。方法:查阅了大量国内外关于FTA卡及其应用方面的文章。结果:详细介绍了FTA卡在模板DNA制备以及在基因的储藏、医学检测以及食源性致病菌的检测方面的具体应用。结论:FTA卡可作为一种通用、快速、简便的DNA模板制备方法可用于生物学各方面的研究。

FTA卡直接扩增缓冲增强剂的研制

目的研制一种能够配合非直接扩增试剂应用的PCR缓冲增强剂,实现对FTA卡保存样本的直接扩增。方法基于常规STR复合扩增试剂盒的扩增体系及引物组,加入增强剂对FTA卡类样本进行直接扩增。结果获得样本STR分型结果清晰、完整、平衡性好,无明显抑制现象存在。结论所研制的FTA卡直扩增强剂能达到FTA卡保存样本的直接扩增检验要求,可应用于法医STR检验。

荧光PCR-16SrDNA测序法鉴定金黄色葡萄球菌的FTA卡制备DNA模板条件的优化

目的：优化荧光PCR-16SrDNA测序法鉴定金黄色葡萄球菌的FTA卡DNA模板制备的条件。方法：以金黄色葡萄球菌菌株为样品，将不同浓度菌液滴在FTA卡上，并用打孔器打出不同直径卡片，分别进行荧光PCR-16SrDNA测序，根据荧光PCR的Cp值和测序结果优化最合适的FTA卡制备DNA模板条件。结果：采用直接扩增法进行SYBRGreen荧光PCR反应时，在直径为0．5、1．0和2．0mm的卡片中，只有0．5mm的卡片获得扩增产物。6．0x10^4-7cfu／mL菌液制备的FTA样品卡，SYBRGreen荧光PeR扩增的cp值在14．8-28．2范围内，其测序产物数据较为理想。结论：6．0x10^4-7cfu／mL菌液制成的VIA样品卡，打出直径为0．5mm卡片，适于荧光PCR-16SrRNA测序法鉴定金黄色葡萄球菌。

FTA卡采集和常温保存肋软骨组织的方法

目的建立一种快捷有效的肋软骨组织采集和保存方法。方法用FTA卡采集尸体肋软骨匀浆,使肋软骨组织吸附在FTA卡上,采用直扩法检验STR分型。肋软骨FTA卡采用真空物证袋密封,常温下保存两年,采用直扩法检验STR分型。结果肋软骨FTA卡采用直扩法检验可得到完整的STR分型图谱,158份检材检出率为93.0%。有效检出分型的肋软骨组织在FTA卡上常温保存两年,STR分型检出率为100%。结论本方法既可通过直扩来替代传统肋软骨组织提取DNA的繁琐步骤,又可解决肋软骨在常温下难以保存的难题。

FTA卡在微量血痕DNA多态性分析中的应用

目的探索FTA卡样本DNA最小检出量及同一FTA卡样本进行多项目检测的可行性。方法制作含有不同浓度DNA FTA卡,使用Identifiler试剂盒进行检验;对同一FTA卡样本先后使用Identifiler、Y-filer试剂盒进行扩增及线粒体高变区HVI区测序,使用ABI3130测序仪检测各扩增产物。结果载有0.5ngDNA的FTA卡扩增产物即可正确分型,对同一血痕样本使用不同试剂盒检验,均可清晰正确判型,线粒体高变区HVI区测序图清晰,且各检验结果均与对照一致。结论载有0.5ngDNA的FTA卡扩增产物可用于DNA分型检测,FTA卡对DNA结合较稳定,可用于多项目检测。

FTA-DNA直接提取法在病原真菌分子鉴定中的应用

目的建立并评价FTA-DNA直接提取法在病原真菌分子鉴定中的应用。方法采用whatman FTA-DNA直接提取法从25个不同种属的45株培养的菌株和6例临床标本中提取病原真菌DNA,用于病原真菌的测序鉴定。配制不同浓度的孢子悬液探索该方法的检测限和安全性。结果 45株菌株扩增后均能得到1条清晰的DNA扩增片段,并成功测序。应用该方法亦成功从腹水、胸水、口腔拭子、宫颈拭子来源的临床标本中直接提取DNA并成功鉴定病原真菌。该DNA提取方法联合降落PCR能检测到1.0×103个cell/mL的孢子悬液,1.0×104个cell/mL及以下浓度的孢子悬液可以被FTA卡完全灭活。结论 FTA-DNA直接提取法可快速有效地从培养的菌株及部分临床标本中提取并保存病原真菌DNA,用于病原真菌的测序鉴定。

FTA-DNA直接提取法的研究与应用

目的建立一种简约且易于自动化操作的Whatman FTA卡血样DNA提取方法。方法取直径1．2mm FTA卡血样，分别用FTA-DNA直接提取法及FTA常规提取方法提取DNA，AB-Identifiler^TM试剂盒分别进行10山和25山体系检测比较，并筛选批量grA卡血样DNA自动化提取程序。结果200份grA卡血样分别采用2种方法提取DNA模板，25μl体系PCR-STR检测，分型结果均良好。10μl体系检测，FTA-DNA直接提取法优于FTA常规提取方法，图谱RFU值为1000～2000，采用自动化工作站运行该提取程序较手工操作DNA分型图谱均衡性更佳；采用FTA常规提取方法检测，图谱RFU值100～2000，小片段优先扩增现象明显，且有19％的样本出现丢峰现象，采用自动化工作站运行该程序对其结果改善不明显。经工作站运行FTA-DNA直接提取法自动程序及10山体系检测本2万余份FTA卡采集的血样，均获得16个STR基因座DNA分型结果。结论本文建立的FTA-DNA直接提取法适用于FTA卡血样自动化DNA建库。

田鼠巴贝虫感染FTA-环介导等温扩增检测技术的建立

目的建立敏感、特异、高效的检测田鼠巴贝虫FTA-环介导等温扩增技术(LAMP)。方法根据GenBank公布的田鼠巴贝虫基因序列,就细胞色素B基因保守序列设计了多套LAMP引物,利用LAMP RealTime Turbidimeter LA-320仪筛选最佳引物、反应条件,建立LAMP检测方法,从保存有血液样本的FTA卡片中提取田鼠巴贝虫DNA进行LAMP,观察检测效果。结果设计的4组引物做LAMP试验,其中以引物1,最佳反应温度为64℃,恒温下作用,敏感性高,可在1h内完成,其检出限量为0.687fg/μL,而PCR的最低检测量为0.687pg/μL,与间日疟原虫、恶性疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫、冈地弓形虫、利什曼原虫、冈比亚锥虫均无交叉反应。以建立的FTA-LAMP法检测20份PCR检测阳性的田鼠巴贝虫感染者血样,其阳性符合率100%。结论成功建立了检测田鼠巴贝虫特异性细胞色素B基因的FTA-LAMP方法,该法特异性强、灵敏度高、简便、快速、适于现场应用。

NASS唾液卡在唾液核酸采集中的应用研究

目的探讨NASS唾液卡在唾液核酸采集中的应用效果。方法对NASS唾液卡与FTA唾液卡进行抗菌能力测试和防霉能力测试;使用两种唾液卡分别采集21份人员口腔拭子,通过Identifiler Plus试剂盒进行PCR直接扩增,对STR基因座峰面积进行配对t检验;使用两种唾液卡各采集1000份人员口腔拭子,通过Identifiler Plus试剂盒复合扩增检测STR分型。结果抗菌能力测试中NASS唾液卡对大肠杆菌的抑菌率大于99.9%,FTA唾液卡对大肠杆菌的抑菌率大于94.4%,对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌两种唾液卡抑菌率均大于99.9%;防霉能力测试中,21天时NASS唾液卡的长霉级别为2级,FTA唾液卡为3级,其他条件下二者无差别;NASS唾液卡和FTA唾液卡对PCR均存在一定程度的抑制,NASS唾液卡在D7S820、D13S317、TPOX、FGA基因座峰面积大于FTA唾液卡(0.01<P<0.05),在CSF1PO、D2S1338、D18S51基因座峰面积显著大于FTA唾液卡(P<0.01),其余基因座无统计学意义(P>0.05);批量检测中,NASS唾液卡检出率为98.3%,FTA唾液卡检出率为97.9%。结论 NASS唾液卡在抗菌、防霉能力以及对PCR扩增的抑制程度方面优于FTA唾液卡,适合在唾液核酸采集中应用。

FTA样本洗提卡用于子宫颈癌筛查的临床应用价值

目的探讨固体FTA样本洗提卡(FTA卡)在宫颈癌筛查的HPV DNA分型检测中作为储存与转运待检样本载体的临床应用价值。方法以北京大学深圳医院宫颈门诊因HPV或细胞学检查阳性行阴道镜下宫颈活检的102例患者为研究对象,由妇科医师采集宫颈脱落细胞样本,分别使用固体FTA卡和细胞保存液作为样本储存和转运的介质,均采用PCR为基础的质量阵列基质辅助激光电离解析飞行时间质谱系统(MALDI-TOF)法进行高危型HPV分型检测,比较FTA卡与常规的液体介质作为样本储存与转运载体在宫颈癌筛查中的有效性。结果102例患者中,液体介质保存的样本检测的HPV感染率为69.6%,FTA卡为66.7%,两组比较,差异无统计学意义(χ~2=0.250,P>0.05)。两种保存方法检测HPV阳性率有很好的一致性(Kappa值=0.932,P<0.001)。两种方法检测的HPV型别比较,差异无统计学意义(χ~2=0.250,P>0.05),且两者具有很好的一致性(Kappa=0.930,P<0.001)。以病理诊断为金标准,FTA卡和液体介质保存样本检测HPV对于检出≥CIN2的曲线下面积分别为0.718和0.699(P<0.05);检出≥CIN3的曲线下面积分别为0.695和0.678(P<0.05)。结论 FTA卡和液体介质保存宫颈细胞样本在HPV分型检测中具有良好的一致性,对于高级别宫颈病变的诊断效率亦相当。由于固体FTA卡体积小、便于转运、污染风险小、且简化了样本DNA的提取,故将其作为一种新的HPV检测样本储存方法用于宫颈癌筛查具有很高的临床应用价值。

FTA-环介导等温扩增技术直接提取变异链球菌DNA的效果评价

背景:变异链球菌是龋病的重要病原菌,及时检测变异链球菌水平对龋病的早发现、早治疗有重要意义。目的:建立并评价FTA-环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术直接提取变异链球菌DNA的应用效果。方法:①制备含有ATCC标准菌株变异链球菌的菌悬液,接种于脑心浸出液培养基,充分混匀后按10倍梯度稀释成7种浓度(4.2×10^(7),4.2×10^(6),4.2×10^(5),4.2×10^(4),4.2×10^(3),4.2×10^(2),4.2×10 CFU/mL),每个稀释级做2个平行对照,并增加无菌水作为空白对照;②分别采用FTA卡、常规煮沸法、试剂盒提取及裂解液提取4种方法直接提取菌株DNA,通过LAMP技术进行扩增,并进行特异性试验,比较4种提取方法的差异。结果与结论:①4种方法提取的DNA均满足LAMP扩增的要求;②特异性试验结果显示,只有变异链球菌才可特异扩增出靶基因;③裂解液提取法最低检测限为4.2×10^(3) CFU/mL,FTA卡提取法最低检测限为4.2×10^(4) CFU/mL,试剂盒提取法和常规煮沸法最低检测限分别为4.2×10^(6) CFU/mL和4.2×10^(7) CFU/mL;④4种提取方法其他方面的比较显示,试剂盒提取法的实验成本、步骤数和时间都是最高;其他3种方法步骤数一致,其中FTA卡所需仪器设备最少,常规煮沸法单次成本最低,裂解液提取法所需时间最少;FTA卡和裂解液提取法仅需少量菌即可提取成功,后者在时间方面优于FTA卡,但相较于FTA卡其单次成本高,所需设备多;⑤结果说明,该研究建立的FTA-LAMP技术具有操作简便、特异性强、灵敏度高、结果可视化等优势,有望为高效提取检测变异链球菌提供新途径。

3种提取基因组DNA方法的比较分析

分别采用3种不同的方法提取基因组DNA,比较所提取的DNA的质量以及提取所需时间、费用,以期选择一种高效、简洁快速、价格合理的提取方法。结果发现这3种方法提取的质量都能达到相关分子生物学试验的要求,但在操作步骤、时间、价格等方面存在差异,具体比较结果可为分子生物学试验选择提取方法提供依据。

两种方法制备模板DNA在PCR-SSCP中的应用研究

目的:比较两种方法(DNA试剂盒提取法和FTA卡法)提取的DNA在PCR—SSCP反中的可靠性。方法:用DNA试剂盒从全血中提取DNA和用NaOH方法从FTA卡中提取DNA后,用分光光度计检测两种方法提取DNA的浓度及纯度,进行PCR反应之后,用2%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量,接着进行SSCP检测,观测其效果。两种方法提取的样品相同,进行PCR反应和SSCP检测的条件完全一致。结果:用DNA试剂盒提取法和FTA卡法提取的DNA纯度分别为OD260/280=1.817,OD260/280=1.806。48份贵州荷斯坦奶牛DNA后续PCR反应和SSCP的检测结果表明,两种方法提取的DNA用于PCR反应和SSCP检测其效果没有明显差别,成功率为100%。结论:FTA卡结合DNA较稳定,用NaOH法提取DNA效果可靠且比试剂盒方法简便、快捷、经济,值得推广。

一种快速批量提取拟南芥DNA的方法

拟南芥是基因功能研究的模式植物，其DNA提取是突变体筛选与鉴定的必要环节。本研究利用FTA卡便能快捷地提取拟南芥叶片DNA。通过与CTAB法和试剂盒法提取DNA相比较：FTA卡法一方面操作简单、省时，成本低；另一方面其提取的DNA为模板，PCR扩增得到的条带同样清晰、完整、得率高；此外，FTA卡上的DNA可在室温下长久保存，且比EP管更节省存储空间。一个完整的叶片即可以进行上百次PCR反应，适合应用到基因图位克隆、突变体批量筛选与鉴定等实验，这将极大地节约实验成本、劳力以及时间，加快实验进程。