FTA滤膜用于PCR检测肉中的金黄色葡萄球菌

利用FTA滤膜,采用PCR技术可直接检测肉及肉制品中的金黄色葡萄球菌,无需增菌,灵敏度高。在采用浮选与溶剂萃取相结合方法的基础上,使用FTA膜可高效地从鲜肉中提取金黄色葡萄球菌的DNA,消除PCR反应的抑制因子。以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)为靶基因,经过PCR扩增得到279bp的产物。经过DNA测序证实该产物为目的扩增产物。使用FTA滤膜处理样品,再通过PCR方法检测金黄色葡萄球菌,猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉匀浆液的检出限均为10cfumL,可在6h内完成对肉中金黄色葡萄球菌的检测,比目前普遍采用的先增菌再进行PCR检测的方法缩短了12～24h。实际检测了72份样品,同时与GB4789.1094方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌检测方法做比较,PCR方法的检出率为72.2%,检出时间为6h,GB4789.1094方法检出率为70.8%,检出时间为5d,PrfilmRSA方法的检出率为61.1%,检出时间为18h,BairdParkerR.P.F方法的检出率为69.4%,检出时间为18h,结果表明FTA滤膜用于PCR检测肉中金黄色葡萄球菌检出率高,耗时短。使用FTA滤膜法制备模板DNA,为食品中的致病菌快速检测构建了一个技术平台。

FTA滤膜用于PCR检测肉中的沙门氏菌

在采用浮选与溶剂萃取相结合方法的基础上,使用FTA滤膜从鲜肉中提取沙门氏菌的DNA,消除PCR反应的抑制因子。以沙门氏菌编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的invA基因为靶基因,经过PCR扩增得到376bp的产物,经过DNA测序证实该产物为目的扩增产物。使用FTA滤膜处理样品,再通过PCR方法检测沙门氏菌,猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉匀浆液的检出限均为7×101CFU/ml,可在6h内完成对肉中沙门氏菌的检测,比目前普遍采用的先增菌再进行PCR检测的方法缩短了12～24h。实际检测了72份样品,同时与GB/T4789.4—2003方法做比较,本方法的检出率为27.8%,检出时间为6h;GB/T4789.4—2003方法检出率为22.2%,检出时间为5d。结果表明:FTA滤膜用于PCR检测肉中沙门氏菌检出率高、耗时短。使用FTA滤膜法制备模板DNA,为食品中的致病菌快速检测构建了一个技术平台。

FTA滤膜用于多重PCR检测豆制品中3种食源性致病菌的研究

为建立豆制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、福氏志贺氏菌的多重PCR检测方法,采用FTA滤膜从豆制品中直接提取模板DNA,根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的phoP基因、福氏志贺氏菌的ipaH基因,设计3对特异性引物进行多重PCR,并对反应条件进行优化。结果表明:3对引物能特异性扩增出280、409、326bp的目的条带;不增菌的情况下,多重PCR同时检测3种致病菌的灵敏度分别是101、101、102CFU/ml,检测时间4h。建立的三重PCR具有准确、快速、高效的特点,为同时检测豆制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、福氏志贺氏菌提供了新的方法。

FTA滤膜用于PCR检测肉中志贺氏菌的研究

建立直接从肉中检测志贺氏菌的快速、敏感、特异的PCR检测方法.根据GenBank公布的志贺氏菌属的侵袭性质粒抗原基因IpaH的保守序列设计特异性引物,经过PCR扩增得到393 bp的产物.经过DNA测序证实该产物为目的扩增产物.使用FTA滤膜处理样品,再通过PCR方法检测志贺氏菌.猪肉、牛肉、羊肉检测的检出限均为10 CFU/mL匀浆,可在6 h内完成对肉中志贺氏菌的检测.FTA滤膜用于PCR检测肉中志贺氏菌灵敏度高,耗时短,为肉中志贺氏菌的快速检测提供了新的方法.

FTA滤膜用于PCR检测豆制品中蜡样芽孢杆菌的研究

采用FTA滤膜从豆制品中直接提取模板DNA,根据蜡样芽孢杆菌的hblA基因设计一对特异性引物进行PCR,并对反应条件进行优化.结果表明该引物能特异性扩增出338bp的目的条带;不增菌的情况下,PCR检测蜡样芽孢杆菌的灵敏度是102CFU/mL,检测时间为4h.

FTA滤膜与环介导等温扩增技术结合快速检测消毒乳中的蜡样芽孢杆菌

目的:建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测蜡样芽孢杆菌的方法。方法:根据公布的蜡样芽孢杆菌溶血素基因的hblA基因的保守序列设计引物,将FTA滤膜提取DNA与LAMP法相结合,检测蜡样芽孢杆菌和人工污染蜡样芽孢杆菌的消毒乳。结果:LAMP方法检测灵敏度高,蜡样芽孢杆菌的检出限为4.4cfu/mL,比PCR检测灵敏度高10倍;人工污染消毒乳中蜡样芽孢杆菌的检出限为57cfu/mL。LAMP扩增可在20min内完成,对消毒乳中蜡样芽孢杆菌的检测(包括DNA提取、LAMP和电泳)可在2h内完成。结论:初步建立LAMP检测蜡样芽孢杆菌的快速检测方法,该方法灵敏度高、特异性好、耗时短,为食品中蜡样芽孢杆菌快速检测构建了一个技术平台。

FTA滤膜与多重PCR结合检测肉中3种食源性致病菌

采用FTA滤膜从肉中直接提取模板DNA,根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的IpaB基因、福氏志贺氏菌的ipaH基因设计3对特异性引物,进行多重PCR检测。结果表明,3对引物能特异性扩增出210、280、393bp大小的目的条带;在不增菌的情况下,多重PCR同时检测肉中3种致病菌的灵敏度均为102cfu/g,检测时间6h。该检测方法准确、快速、高效,为同时检测肉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、福氏志贺氏菌奠定了基础。

FTA滤膜用于基因芯片检测肉中常见食源性致病菌的研究

通过不对称PCR技术和基因芯片技术建立一种准确、快速和高敏感性的检测肉中常见食源性致病菌的方法。用FTA滤膜从食品样品中直接提取模板DNA,用玻片作基因芯片的固相载体。选择常见的可引起食物中毒的15株菌的16SrDNA基因的一个片段作为目的基因。设计这段基因的一对通用引物,下游引物用Cy5标记。设计25条种属的特异性探针,将它们氨基化修饰并点到玻片上,将不对称PCR的15种扩增产物与制作好的基因芯片杂交,用genepix4分析杂交结果。结果表明:10株食源性致病菌(金黄色葡萄球菌、肉毒梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、宋内氏志贺氏菌、霍乱弧菌、普通变形杆菌、拟态弧菌、单核增生李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、腊样芽孢杆菌)的检测具有高敏感性和特异性;副溶血性弧菌的敏感性相对较低;河流弧菌同副溶血性弧菌存在很弱的错杂交;乙型溶血性链球菌的检测同单核增生李斯特菌和腊样芽孢杆菌存在很弱的错杂交,但是均不影响检测结果。大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌由于同源性非常高,可以通过多重PCR方法检测出来。整个样品的检测耗时6h。基因芯片与其它检测方法相比有很大的优势,它不仅准确、快速、高效,而且高通量,可广泛应用于食源性致病菌感染的诊断、应对和控制。

FTA滤膜用于PCR检测单核细胞增生李斯特氏菌的研究

建立单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria moncytones,LM)快速、敏感、特异的PCR检测方法。利用FTA滤膜提取模板DNA,采用PCR特异性扩增单增李斯特菌的溶血素基因(HlyA),并评价该方法的特异性与灵敏性。引物能特异性的扩增单增李斯特的HlyA基因,而其他细菌的扩增结果均呈现阴性;利用FTA滤膜提取模板直接检测单增李斯特具有较高的灵敏度,灵敏度为102cfu/mL。利用FTA滤膜提取模板,操作简便,成本低且具有较高的灵敏度,为食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测提供新的手段。

正交优化多重PCR反应体系检测3种食源性致病菌的研究

[目的]建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的快速、敏感、特异的多重PCR检测方法。[方法]根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的IpaB基因、志贺氏菌的ipaH基因,设计3对特异性引物进行多重PCR检测,利用正交设计对多重PCR反应体系的镁离子、Taq酶、dNTP、引物的浓度在4个水平上进行L16(44)优化试验,并确定该检测方法的特异性与灵敏度。[结果]3对引物能特异性扩增出210、280、393 bp的目的条带。利用FTA滤膜提取模板DNA,采用建立多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度,灵敏度金黄色葡萄球菌为3.5×102cfu/ml、沙门氏菌为2.2×102cfu/ml、志贺氏菌为1.0×102cfu/ml。[结论]该检测方法准确、快速、高效,为同时检测食品中多种致病菌奠定了基础。

肉中金黄色葡萄球菌PCR检测模板的制备方法

对FTA滤膜用于肉中金黄色葡萄球菌PCR直接检测(无需增菌)模板制备的具体方法进行了研究。结果表明,使用FTA滤膜制备模板时,FTA滤膜吸附样品,干燥后采用10%SDS煮沸该滤膜,可消除结合在FTA滤膜上的PCR抑制因子,采用该方法制备的模板可有效地扩增出目的基因。因此,使用FTA滤膜法制备模板DNA,为快速检测食品中的致病菌构建了一个技术平台。