FTY720-P对破骨细胞EphA2-EphrinA2双向信号通路作用的研究

目的探讨FTY720-P对破骨细胞Eph A2-Ephrin A2双向信号通路的影响。方法取小鼠巨噬细胞RAW264.7,采用地塞米松及1α,25-二羟维生素D3诱导分化为破骨细胞,并行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色鉴定。将诱导培养的破骨细胞分为两组,实验组给予400 ng/m L的FTY720-P处理,对照组不给予FTY720-P。培养48 h后,取细胞行实时荧光定量PCR检测、Western blot检测以及免疫荧光染色观察,分析细胞中Eph A2、Ephrin A2、Rho A,以及骨重建相关蛋白BMP-2及TGF-β_1的表达。结果经TRAP染色鉴定,RAW264.7细胞成功诱导成为破骨细胞。培养48 h后,与对照组相比,实验组Eph A2及Ephrin A2 m RNA及蛋白相对表达量均明显降低(P<0.05),Rho A蛋白相对表达量也明显降低(P<0.05);BMP-2及TGF-β1 m RNA相对表达量明显增高(P<0.05),蛋白表达增强。结论 FTY720-P能通过影响破骨细胞Eph A2-Ephrin A2双向信号通路之间的传导下调Rho A,并促进TGF-β_1和BMP-2表达,最终影响破骨细胞的破骨作用。

FTY720-P对MC3T3-E1细胞分化成熟的作用研究

目的探讨FTY720-P对MC3T3-E1细胞分化成熟的作用。方法取MC3T3-E1细胞,分为实验组和对照组。实验组以400 ng/mL FTY720-P(以氯仿为溶剂)作用于细胞,建立体外诱导成骨分化模型;对照组培养基中仅加入氯仿。培养48 h后,倒置相差显微镜观察两组细胞形态;免疫荧光染色检测两组成骨细胞相关蛋白Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达;ALP染色及茜素红染色观察两组成骨细胞形成情况及矿化结节形成情况;TUNEL荧光法检测两组细胞凋亡情况。结果培养48 h后,可见两组细胞均已长满瓶底,呈梭形,细胞形态无明显差异。免疫荧光染色显示,实验组Ⅰ型胶原蛋白表达呈阳性,对照组呈弱阳性;实验组的Ⅰ型胶原蛋白积分吸光度(IA)值为187 600±7 944,显著高于对照组的14 230±1 070,差异有统计学意义(t=43.680,P=0.001)。实验组和对照组Ⅲ型胶原蛋白表达均呈弱阳性,两组Ⅲ型胶原蛋白IA值比较差异无统计学意义(t=1.976,P=0.119)。实验组细胞ALP染色和茜素红染色均呈阳性,而对照组均呈阴性。实验组TUNEL染色呈阳性,对照组呈阴性;实验组TUNEL染色细胞阳性率为35.82%±2.99%,显著高于对照组的2.28%±0.51%(t=23.420,P=0.002)。结论 FTY720-P可以促进MC3T3-E1细胞成骨分化,加快细胞外基质成熟和矿化,且能影响细胞凋亡。

FTY720-P联合同种异体骨移植修复兔桡骨大段骨缺损的实验研究

目的探索FTY720-P联合同种异体骨移植修复兔桡骨大段骨缺损的效果。方法 36只新西兰大白兔右侧桡骨中段建立15mm骨缺损模型后随机分为3组,A组移植FTY720-P溶液浸泡后的同种异体骨,B组移植未做处理的同种异体骨,C组移植自体桡骨。术后4、8、12周通过影像学检查,组织学、免疫组织化学检测及三点弯曲实验评估骨缺损修复效果。结果术后12周,A、C组移植骨与宿主骨达到骨性愈合。术后4、8、12周A、C组骨缺损区域骨痂形成量多于B组,并且A、C组Lane-Sandhu评分均高于B组,差异有统计学意义(P<0.05),而A、C组间Lane-Sandhu评分比较,差异无统计学意义(P>0.05)。组织学检查显示,术后4周B组移植骨周围见较多炎性细胞,而A组炎性细胞少见;术后8周A组移植骨内新生血管生成。术后4周各组内源性骨形态发生蛋白-2(BMP-2)在新生成骨质的骨陷窝、新生骨附近成骨细胞细胞质及纤维性骨痂基质内呈强阳性表达。三点弯曲实验显示,A组修复后的桡骨最大弯曲强度大于B组(P<0.05),与C组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 FTY720-P联合同种异体骨能较好地修复兔桡骨大段骨缺损,且达到与自体骨修复相当的效果。