FUT8基因RNAi慢病毒载体的构建及对MCF-7细胞增殖的影响

旨在构建FUT8基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并观察其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。针对FUT8基因设计3组短发夹RNA序列,退火合成双链DNA,通过连接线性化的p GC-LV-GFP载体,构建mi RNA慢病毒载体质粒,并将其转化至感受态细胞DH5α;测序验证正确后进行FUT8基因慢病毒载体的包装及病毒滴度测定,将获得的重组慢病毒p GC-sh FUT8转染MCF-7细胞,利用Real time-PCR、Western blot分别验证转染后MCF-7细胞中FUT8 m RNA及蛋白的表达,MTT法及克隆形成实验检测sh FUT8对MCF-7细胞增殖能力的影响。测序证实成功构建针对FUT8基因的RNAi慢病毒载体;慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒悬液滴度>5×108 TU/m L;荧光显微镜下观察各转染组细胞GFP的表达,转染效率达90%以上;Real-time PCR、Western blot结果显示干扰组FUT8的m RNA及蛋白表达水平较对照组显著降低,其中p GC-sh FUT8-2序列对FUT8基因的干扰效率可达80%,干扰效果最佳,FUT8沉默后MCF-7细胞增殖能力下降。

核心岩藻糖基转移酶Fut8基因敲除小鼠肠道菌群特征

目的探究Fut8基因敲除对ICR小鼠肠道菌群结构的影响。方法分别在Fut8^(+/+)和Fut8^(-/-)小鼠出生后不同时间点检测体重,采集粪便样本,采用PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)的方法检测小鼠粪便中菌群的组成;利用高效液相色谱法(HPLC)测定Fut8^(+/+)和Fut8^(-/-)小鼠Fut8酶活。结果 Fut8^(-/-)小鼠与Fut8^(+/+)小鼠相比生长缓慢(P<0.05);完全丧失核心岩藻糖基化活性;肠道菌群结构不同,其中拟杆菌门微生物存在显著差异。结论核心岩藻糖基转移酶Fut8基因敲除对小鼠肠道菌群结构有显著影响。