hFXYD6反义核酸对胆管癌细胞体外增殖和侵袭能力的影响

目的:研究hFXYD6基因反义核酸对人胆管癌QBC939细胞体外增殖和侵袭能力的影响.方法:构建hFXYD6基因反义核酸真核表达载体pcDNA3.1(-)/hFXYD6(-)并转染人胆管癌QBC939细胞,同时设pcDNA3.1(-)空载体对照组和空白对照组.SYBR GreenⅠ荧光定量RT- PCR和免疫组化分别检测hFXYD6 mRNA及蛋白表达;MTT、平板克隆形成实验检测细胞体外增殖活性:流式细胞仪检测细胞周期;Transwell侵袭小室模型检测细胞体外侵袭能力.结果:与空白组和空载组比较,反义组细胞hFXYD6 mRNA及蛋白表达量降低;细胞群体倍增时间增加(46.8 h vs 34.5 h,35.3 h),细胞克隆形成率降低(24.3%±5.3% vs 61.0%±8.5%,58.0%±5.6%,P<0.001);细胞周期中G1期细胞比例明显升高(66.4%±2.9% vs 33.5%±2.3%,39.4%±3.7%,P<0.001),S期比例明显减少(18.6%±1.6% vs 36.2%±2.1%,34.1%±1.6%,P<0.001);Transwell侵袭小室中24 h穿膜细胞数无显著改变.空白组和空载组细胞间均无明显差异.结论:hFXYD6反义核酸抑制人胆管癌QBC939细胞体外增殖能力,但对其侵袭能力无明显作用.

FXYD6 shRNA表达载体的构建及其在体外对胰腺癌细胞增殖的影响

目的:构建FXYD6短发夹RNA(shRNA)表达载体,体外评价其对胰腺癌细胞sw1990的增殖与FXYD6蛋白表达的抑制效果。方法:基于microRNA mir-30天然结构,设计表达4对FXYD6shRNA的互补DNA序列,克隆入pCGM30质粒载体,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,PCR法筛选阳性克隆,经酶切和基因测序鉴定;利用LipofectAMINE2000将pCGM30-FXYD6shRNA转染至胰腺癌细胞sw1990,MTT法检测转染后胰腺癌细胞增殖的变化,Western blot检测胰腺癌细胞中FXYD6蛋白表达水平的变化。结果:设计合成了4对表达FXYD6shRNA的互补DNA序列,构建了4个表达FXYD6shRNA的重组质粒;基因测序证实shRNA编码序列与设计的片段完全一致,酶切鉴定证实载体构建成功;体外实验表明,转染胰腺癌细胞sw1990的增殖能力和FXYD6蛋白表达水平明显降低(P<0.05),FXYD6蛋白表达水平随时间延长逐渐降低(P<0.01),但细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)。结论:构建了4个表达FXYD6shRNA的重组质粒载体,可有效抑制FXYD6的表达;抑制胰腺癌细胞sw1990中FXYD6的表达可以抑制细胞的增殖,提示FXYD6可能是一个具有潜在临床应用价值的基因治疗靶点。

离子通道相关蛋白FXYD6功能区的原核表达及纯化

目的构建FXYD6蛋白功能区(FXYD6-ex)的原核表达质粒,并诱导FXYD6-ex在原核细胞中表达与纯化,以进一步研究FXYD6功能。方法用全长FXYD6 cDNA扩增FXYD6-ex,扩增产物插入克隆质粒载体pMD18-T Simple并用限制性内切酶酶切,将目的片段插入以限制性内切酶切后的表达质粒载体pET28a(+)中,经PCR电泳和测序证实后转化宿主大肠杆菌Rossetta,异丙基-β-8-D硫代半乳糖(IPTG)诱导重组蛋白表达,镍柱纯化重组蛋白,十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶和Western blot检测鉴定蛋白表达及纯化情况。结果成功构建pET28a(+)-FXYD6-ex大肠杆菌表达载体,并实现该蛋白在大肠杆菌中的高表达,分离纯化的产物纯度达90%。结论本研究成功对FXYD6-ex进行原核表达及纯化;此为后续制备该蛋白抗体库及进一步研究其具体功能奠定了良好基础。

含FXYD域离子运输调控因子3对人胰腺癌细胞增殖和迁移的影响

目的探讨含FXYD域离子运输调控因子3(FXYD3)对人胰腺癌细胞增殖和迁移的影响。方法使用免疫组化法、组织病理学和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测21例正常胰腺组织、18例慢性胰腺炎组织和50例胰腺癌组织中FXYD3的表达。分析不同病理特征的胰腺癌中FXYD3的表达水平差异。采用CCK-8法和单克隆实验法检测FXYD3过表达对胰腺癌细胞增殖的影响;采用Transwell法检测FXYD3过表达对胰腺癌细胞侵袭的影响。结果FXYD3阳性细胞在正常胰腺组织、慢性胰腺炎组织和胰腺癌组织样本中的比率分别为0、22.2%和26.0%,FXYD3阳性细胞在慢性胰腺炎组织和胰腺癌组织中的比率较正常胰腺组织中升高,差异有统计学意义(P=0.007、0.037)。FXYD3阳性表达与分期、病理分级、淋巴结转移情况以及肿瘤部位无相关性(P>0.05)。CCK-8法结果显示,FXYD3转染的细胞从第3天开始显示出更强的增殖能力,差异有统计学意义(P<0.01)。平板克隆实验显示,FXYD3过表达的T3M4细胞克隆数目更多,差异有统计学意义(P<0.01)。Transwell法结果显示,FXYD3过表达的T3M4细胞迁移数目较对照组上升,差异有统计学意义(P<0.05)。结论胰腺癌组织中FXYD3显著上调,这主要是由于癌细胞自身表达水平的增高,表明FXYD3促进胰腺癌细胞的增殖。

基于数据库挖掘分析肝细胞癌中含离子转运调控因子1的FXYD结构域的表达及临床意义

目的探讨含离子转运调控因子1的FXYD结构域(FXYD1)在肝细胞癌(HCC)中的表达及临床意义。方法应用GEPIA、TIMER和UALCAN数据库分析FXYD1在HCC中的表达水平,应用Kaplan-Meier Plotter数据库分析FXYD1 mRNA表达水平与HCC患者预后的关系,通过cBioPortal数据库分析FXYD1在HCC患者中的突变情况及与患者预后的关系,应用String数据库构建FXYD1的蛋白质相互作用网络,应用Metascape数据库进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。结果FXYD1在大多数肿瘤(包括HCC)中低表达。FXYD1 mRNA高表达组HCC患者的中位总生存期(OS)和中位无病生存期(DFS)均长于FXYD1 mRNA低表达组患者。约6%的HCC患者发生FXYD1基因突变,FXYD1突变组患者的中位OS和中位DFS均短于FXYD1未突变组患者。应用String数据库共获得了10个与FXYD1相互作用的蛋白质,这些蛋白质主要富集在细胞钾离子稳态、钠钾交换ATP酶复合物、激酶结合和环磷酸腺苷(cAMP)信号通路等。FXYD1的表达水平与多种免疫细胞(B细胞、中性粒细胞和树突状细胞)的浸润呈负相关。结论FXYD1在HCC中低表达,且与HCC患者的预后有关,有望成为HCC诊断和治疗的生物标志物。

FXYD6 蛋白在肝细胞癌中的表达及其临床意义

目的检测FXYD6蛋白在肝细胞癌组织及其癌旁组织中的表达,并分析其临床病理学意义。方法回顾性收集沧州市中心医院2012年3月至2018年1月期间的根治性切除的肝细胞癌蜡块80例及其癌旁组织40例,采用免疫组织化学链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合法(SABC)检测FXYD6蛋白的表达情况,并分析FXYD6蛋白表达与肝细胞癌患者的临床病理学特征、术后早期复发及生存时间的关系。结果FXYD6蛋白在肝细胞癌组织中的表达阳性率高于癌旁组织[77.5%(62/80)比40.0%(16/40),P<0.001]。FXYD6蛋白在肝细胞癌组织中的表达与性别、年龄、肿瘤分化程度、肿瘤最大径、肿瘤数目、术前AFP水平和HBV或HCV感染均无关(P>0.05),而与肿瘤包膜完整性、微血管侵犯和TNM分期均相关(P<0.05)。FXYD6蛋白表达阳性组的早期复发率高于阴性表达组[53.2%(33/62)比16.7%(3/18),P=0.006],然而多因素分析结果显示,FXYD6蛋白表达不是早期复发的独立危险因素(P=0.422)。FXYD6蛋白表达阳性组的术后生存情况差于阴性表达组(P=0.043),然而多因素分析结果显示,FXYD6蛋白表达不是总体生存的独立危险因素(P=0.754)。结论FXYD6蛋白在肝细胞癌组织中高表达,可能参与肝细胞的癌变及其进展,可能是肝细胞癌患者的一个不良预后因素。

米诺地尔对血管平滑肌细胞迁移及高血压相关基因离子转换调节器5表达的影响

目的 探究米诺地尔对血管平滑肌细胞迁移及高血压相关基因离子转换调节器5(FXYD5)表达的影响。方法 体外培养人主动脉血管平滑肌细胞(HASMC),并分为空白组(正常培养HASMC细胞)及低、中、高剂量实验组(分别加入含终浓度为0.1,0.5和1.0 mmol·L^(-1)米诺地尔溶液的不含胎牛血清、含90%高糖的DMEM培养基)。用划痕实验检测各组HASMC细胞的迁移能力,用蛋白质印迹法检测FXYD5、N-钙黏附蛋白(N-cadherin)、Ras同族体基因家族成员A(RhoA)和Rho激酶1(ROCK1)蛋白的表达情况。结果 中、高剂量实验组和空白组的划痕愈合率分别为(45.96±6.85)%,(30.15±4.38)%和(78.94±9.76)%,FXYD5蛋白相对表达水平分别为0.53±0.08,0.16±0.03和1.13±0.16,N-Cadherin蛋白相对表达水平分别为0.45±0.08,0.20±0.03和0.98±0.15,RhoA蛋白相对表达水平分别为0.47±0.08,0.20±0.03和1.06±0.16,ROCK1蛋白相对表达水平分别为0.77±0.12,0.36±0.05和1.25±0.19。中、高剂量实验组的上述指标与空白组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 米诺地尔可通过下调FXYD5表达,抑制RhoA/ROCK通路活化,从而实现对血管平滑肌细胞增殖和迁移的抑制作用。