绵羊卷曲受体1基因克隆、表达谱与多态性分析

【目的】获得绵羊卷曲受体1(frizzled 1,FZD1)基因CDS序列,确定其生物学功能,探索其多态性并明确其在不同品种不同组织中的表达差异。【方法】采集小尾寒羊和新吉细毛羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉和皮肤组织,提取总RNA并反转录成cDNA。依据NCBI数据库中绵羊FZD 1基因预测序列(登录号:XM_027968435.2)设计引物,以小尾寒羊皮肤组织cDNA为模板,采用TA克隆获得目的基因序列,并对序列进行生物信息学分析,预测其可能编码的蛋白质结构和功能;利用实时荧光定量PCR检测FZD 1基因在小尾寒羊和新吉细毛羊不同组织中的表达差异;采用测序和高分辨熔解曲线(high resolution melting analysis,HRM)进行多态性检测,确定可能存在的单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms,SNP)位点。【结果】成功克隆出绵羊FZD 1基因CDS区,序列全长为1941 bp,编码646个氨基酸。绵羊FZD1氨基酸序列与山羊相似性最高,为99.5%,与人的相似性最低,为96.7%;系统进化树结果显示,绵羊FZD1与山羊亲缘关系最近,与人亲缘关系最远。FZD1蛋白含有7个跨膜结构域,42个磷酸化位点和2个N-糖基化位点,主要分布在细胞膜上。FZD1蛋白二级结构预测结果显示,无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角分别占48.30%、35.15%、15.02%和1.55%,与预测的三级结构一致。实时荧光定量PCR结果显示,小尾寒羊FZD 1基因在肌肉和皮肤组织中的表达量显著高于新吉细毛羊,在心脏和肺脏中的表达量显著低于新吉细毛羊(P<0.05)。FZD 1基因在2个品种羊的肺脏和皮肤中的表达量均最高,且显著高于其他组织(P<0.05)。测序结果及HRM验证显示,FZD 1基因第1273和1276 bp位点处存在2个SNPs(g.9443455和g.9443458),这2个SNPs为完全连锁不平衡状态,仅存在2种单倍型,2个SNPs位点均为中度多态。【结论】FZD 1基因CDS全长1941 bp,编码646个氨基酸。FZD1蛋白作为位于细胞膜上的七跨膜受体蛋白,存在42个可能的磷酸化位点,推测FZD1的信号传导是通过磷酸化和去磷酸化进行的;FZD 1基因在小尾寒羊的皮肤组织中表达量最高,提示FZD 1基因可能参与毛囊发育的调控。

Wnt-1、Fzd-1在环磷酰胺致大鼠神经管畸形发生中的表达变化

目的观察Wnt-1、Fzd-1在环磷酰胺致大鼠神经管畸形发生中的表达变化,探讨神经管畸形的发生机制。方法将孕鼠随机分为实验组和对照组,孕13d8:00AM按15mg/kg体重分别腹腔注射环磷酰胺和生理盐水。注射后8、12、24、48h取胎鼠,制备石蜡连续切片。用免疫荧光技术检测Wnt-1、Fzd-1的表达变化。结果注射后8、12h,实验组Wnt-1、Fzd-1的表达与对照组相比无显著性差异;24、48h,Wnt-1、Fzd-1的表达强度均比对照组低,差异有统计学意义。结论环磷酰胺抑制Wnt-1、Fzd-1的表达,干扰Wnt经典通路的传导,是环磷酰胺致神经管畸形的原因之一。

FZD1在肾癌中表达及其临床意义

目的检测FZD1在配对肾癌及癌旁组织,肾癌细胞系与正常细胞系中m RNA表达水平,探讨其表达与临床病理特征之间关系。方法运用RT-PCR荧光定量方法,从基因水平检测FZD1在52对肾癌组织和癌旁组织,肾癌细胞株(ACHN)和正常人肾近端小管上皮细胞株(HK-2)中表达量差异。结果 FZD1的表达量与患者年龄、性别及病理分型无关(P>0.05),但与肿瘤直径、AJCC临床分期、Fuhrman分级、淋巴结转移、远处转移密切相关(P<0.05)。FZD1在肾癌组织和肾癌细胞中表达均上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 FZD1在肾癌中表达明显升高,且与不良预后有关,可能作为肾癌临床预后生物标志物之一。

卵巢癌组织中MDR-1、Wnt-1、FZD-1基因的表达变化及其与化疗耐药的关系

目的观察化疗及非化疗卵巢癌组织中多药耐药基因-1(MDR-1)及Wnt-1、FZD-1基因的表达变化,探讨其与卵巢癌化疗耐药的关系。方法卵巢癌患者60例,包括紫杉醇化疗组(Ⅰ组)和未化疗组(Ⅱ组)各30例,Ⅰ组分为先期化疗有效组(ⅠA组)22例和化疗后复发组(ⅠB组)8例。采用实时荧光定量RT-PCR技术检测各组卵巢癌组织中的MDR-1、Wnt-1、FZD-1基因。结果Ⅰ组MDR-1基因阳性表达率为70%(21/30),Ⅱ组为86%(26/30),两组相比,P>0.05;ⅠB组MDR-1阳性6例(6/8),较ⅠA组的15例(15/22)略高,但两组相比,P>0.05。Wnt-1基因在MDR-1表达阳性的卵巢癌组织中的Ct值为4.742 9±0.756 9,与MDR-1阴性者的3.298 1±1.489 7相比,P<0.01。FZD-1基因在MDR-1表达阳性的卵巢癌组织中的Ct值为3.677 3±1.220 8,与MDR-1阴性者的4.898 0±0.633 9相比,P<0.01。在Ⅰ组中,MDR-1和Wnt-1、FZD-1基因的表达呈正相关(r分别为0.525、0.678,P均<0.05);但在Ⅱ组中,MDR-1和Wnt-1、FZD-1基因的表达无相关性(r分别为-0.091、0.031,P均>0.05)。结论卵巢癌组织中MDR-1基因有较高的阳性表达率,与卵巢癌的化疗耐药有关,MDR-1基因可能通过抑制Wnt-1、FZD-1基因的表达而发挥作用。

RBM38调节FZD1 mRNA稳定性介导急性髓系白血病细胞HL-60的增殖

目的:研究RNA结合基序蛋白38(RBM38)对人急性髓系白血病细胞株HL-60增殖的调控功能和作用机制。方法:分别构建过表达、敲低RBM38的慢病毒载体,使用慢病毒感染HL-60细胞后,Western blot方法检测细胞内RBM38的表达水平,分别用CCK-8法和PI染色结合流式细胞术检测HL-60细胞的增殖和周期,通过RNA免疫共沉淀结合实时定量PCR方法检测RBM38与靶mRNA的结合情况,放线菌素D处理结合实时定量PCR方法检测RBM38对靶mRNA稳定性的影响。结果:通过慢病毒介导的基因转移可成功实现HL-60细胞内RBM38的过表达或表达抑制。过表达RBM38可显著促进HL-60细胞的增殖活性和细胞周期运行;相反,抑制内源性RBM38的表达可抑制HL-60细胞增殖和细胞周期。RBM38可与FZD1 mRNA结合,促进其mRNA的稳定。结论:RBM38通过促进FZD1 mRNA的稳定调节HL-60细胞的增殖。

Wnt-1和FZD-1在小细胞肺癌患者中的表达及临床意义

目的:研究Wnt-1和FZD-1在小细胞肺癌(SCLC)患者中的表达及其与化疗耐药和临床特征的关系。方法选取我院收治的41例SCLC患者,检测外周血单核细胞(PBMC)中Wnt-1和FZD-1的表达水平,分析其与SCLC临床病理学特征及预后的关系。结果化疗耐药组中Wnt-1和FZD-1的表达量均明显高于化疗敏感组(均P<0.05)。Wnt-1与FZD-1表达呈正相关(r=0.186,P<0.05)。FZD-1表达水平与肿瘤临床分期有关(P=0.008),但与患者年龄、性别、吸烟史无关(均P>0.05)。Wnt-1表达水平则与患者的病理临床特征无明显相关性(均P>0.05)。Wnt-1和FZD-1高表达与患者的中位生存时间均密切相关(均P<0.05)。结论 Wnt-1与FZD-1在SCLC患者中呈高表达,并与临床特征和耐药性相关,可以为临床提供一种简便易行的预测化疗耐药的指标。

紫杉醇化疗后卵巢癌组织及细胞株中WNT-1及FZD-1基因蛋白表达的变化及其意义

目的检测卵巢癌细胞株及紫杉醇化疗后卵巢癌组织中WNT-1及FZD-1基因蛋白表达的变化及其意义。方法选用卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV3/TAX及敏感细胞株SKOV3,及58例卵巢癌组织,包括术后紫杉醇化疗后复发患者19例(化疗组),术前未化疗患者39例(未化疗组)。采用免疫组化二步法,检测卵巢癌组织及细胞中WNT-1及FZD-1基因的蛋白表达。结果 1.卵巢癌组织中:化疗组WNT-1及FZD-1的蛋白表达光密度值较未化疗组明显降低(分别为30931.34±16420.04 vs 45917.65±12015.39;38625.20±19689.97 vs 55585.82±26330.13),以上差异均有统计学意义(P<0.05);光镜下观察耐药细胞株中WNT-1及FZD-1蛋白表达强度均明显低于敏感株;2.化疗组WNT-1蛋白表达在子宫内膜样腺癌中明显低于浆乳癌(19215.88±6506.49 vs 43193.53±16803.05,P=0.014);未化疗组各基因蛋白表达在年龄、临床分期,分化程度和病理类型中均无显著性差异。3.总体上FZD-1与WNT-1蛋白表达呈显著正相关(r=0.479,P=0.000),化疗组及未化疗组中WNT-1与FZD-1蛋白表达也均呈正相关(分别为r=0.551、P=0.015;r=0.345、P=0.032)。结论 WNT-1、FZD-1基因蛋白表达下调可能与卵巢癌紫杉醇化疗耐药有一定相关性。