FZD1在肾癌中表达及其临床意义

目的检测FZD1在配对肾癌及癌旁组织,肾癌细胞系与正常细胞系中m RNA表达水平,探讨其表达与临床病理特征之间关系。方法运用RT-PCR荧光定量方法,从基因水平检测FZD1在52对肾癌组织和癌旁组织,肾癌细胞株(ACHN)和正常人肾近端小管上皮细胞株(HK-2)中表达量差异。结果 FZD1的表达量与患者年龄、性别及病理分型无关(P>0.05),但与肿瘤直径、AJCC临床分期、Fuhrman分级、淋巴结转移、远处转移密切相关(P<0.05)。FZD1在肾癌组织和肾癌细胞中表达均上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 FZD1在肾癌中表达明显升高,且与不良预后有关,可能作为肾癌临床预后生物标志物之一。

RBM38调节FZD1 mRNA稳定性介导急性髓系白血病细胞HL-60的增殖

目的:研究RNA结合基序蛋白38(RBM38)对人急性髓系白血病细胞株HL-60增殖的调控功能和作用机制。方法:分别构建过表达、敲低RBM38的慢病毒载体,使用慢病毒感染HL-60细胞后,Western blot方法检测细胞内RBM38的表达水平,分别用CCK-8法和PI染色结合流式细胞术检测HL-60细胞的增殖和周期,通过RNA免疫共沉淀结合实时定量PCR方法检测RBM38与靶mRNA的结合情况,放线菌素D处理结合实时定量PCR方法检测RBM38对靶mRNA稳定性的影响。结果:通过慢病毒介导的基因转移可成功实现HL-60细胞内RBM38的过表达或表达抑制。过表达RBM38可显著促进HL-60细胞的增殖活性和细胞周期运行;相反,抑制内源性RBM38的表达可抑制HL-60细胞增殖和细胞周期。RBM38可与FZD1 mRNA结合,促进其mRNA的稳定。结论:RBM38通过促进FZD1 mRNA的稳定调节HL-60细胞的增殖。

FZD1基因对小细胞肺癌多药耐药作用研究

目的:探讨FZD1在小细胞肺癌多药耐药中的作用。方法:运用QRT-PCR和蛋白质印迹法,分别从基因和蛋白水平检测小细胞肺癌敏感细胞株H69及耐药细胞株H69AR中FZD1的差异表达,同时运用QRT-PCR检测化疗敏感及耐药患者血液标本中FZD1的差异表达;采用siRNA抑制耐药细胞株H69AR中FZD1的表达,通过CCK8检测细胞对各种化疗药物(ADM,DDP,Vp-16)敏感性的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。结果:无论是基因水平还是蛋白水平,FZD1在H69AR细胞中的表达明显高于H69细胞,差异有统计学意义,P值分别为0.003和<0.001;FZD1在化疗耐药患者血液标本中的表达较化疗敏感者明显增高,差异有统计学意义,P<0.001。下调H69AR细胞株中FZD1的表达能够增加细胞对化疗药物的敏感性,差异有统计学意义,P=0.020;H69AR细胞组的凋亡率为(2.037±0.49)%,较H69细胞组(9.63±0.67)%明显降低,差异有统计学意义,P=0.002。下调H69AR细胞中FZD1的表达后,H69ARSi-FZD1组细胞的凋亡率为(17.093±0.904)%,明显高于空白对照H69AR及阴性对照H69AR-NC组的(2.25±0.967)%,差异有统计学意义,P=0.007。结论:FZD1参与调节小细胞肺癌的多药耐药,下调FZD1基因的表达能够增加细胞对化疗药物的敏感性,FZD1可能通过抑制细胞凋亡而影响小细胞肺癌的多药耐药。

灯盏花对血管内皮细胞损伤大鼠Wnt/β-catenin信号通路及炎症介质的影响

目的:研究灯盏花素对血管内皮细胞损伤大鼠的保护机制及对Wnt/β-catenin信号通路的作用机制。方法:选取60只SD大鼠,随机分为健康组、模型组、灯盏花素低剂量组(BL组)、灯盏花素高剂量组(BH组),每组15只。采用苏木精-伊红(HE)染色观察血管形态;逆转录PCR测Wnt信使RNA(mRNA)、卷曲蛋白1(FZD1) mRNA、轴蛋白1(AXIN1) mRNA、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β) mRNA、β-连环素mRNA、血管内皮生长因子(VEGF) mRNA;酶联免疫吸附试验测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP);显微镜观察血管内皮细胞形态;MTT测血管内皮细胞增殖;蛋白质印迹法(Western Blotting)测Wnt、FZD 1、AXIN1、GSK-3β、β-连环素、VEGF水平。结果:健康组大鼠血管内无明显改变;模型组有明显血管损伤;BL组与BH组大鼠血管损伤有所改善,且以BH组效果明显。与健康组比较,模型组血管内皮细胞间隙宽、细胞形态变小、脱落;BL组血管内皮细胞与模型组较为接近;BH组血管内皮细胞间隙变窄且凋亡减少,形态有所改善。与健康组比较,模型组Wnt、VEGF、FZD1、β-连环素、AXIN1、血管内皮细胞不同时间点OD值均降低,GSK-3β、TNF-α、CRP、血管内皮细胞凋亡率升高(P<0.05),与模型组比较,BL组与BH组Wnt、VEGF、FZD1、β-连环素、AXIN1、血管内皮细胞不同时间点OD值均升高,GSK-3β、TNF-α、CRP、血管内皮细胞凋亡率降低(P<0.05),且以BH组效果更为显著(P<0.05)。结论:灯盏花素通过调控Wnt/β-catenin信号通路表达,控制血管的稳定性,从而对血管内皮细胞损伤大鼠的起保护作用。

绵羊卷曲受体1基因克隆、表达谱与多态性分析

【目的】获得绵羊卷曲受体1(frizzled 1,FZD1)基因CDS序列,确定其生物学功能,探索其多态性并明确其在不同品种不同组织中的表达差异。【方法】采集小尾寒羊和新吉细毛羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉和皮肤组织,提取总RNA并反转录成cDNA。依据NCBI数据库中绵羊FZD 1基因预测序列(登录号:XM_027968435.2)设计引物,以小尾寒羊皮肤组织cDNA为模板,采用TA克隆获得目的基因序列,并对序列进行生物信息学分析,预测其可能编码的蛋白质结构和功能;利用实时荧光定量PCR检测FZD 1基因在小尾寒羊和新吉细毛羊不同组织中的表达差异;采用测序和高分辨熔解曲线(high resolution melting analysis,HRM)进行多态性检测,确定可能存在的单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms,SNP)位点。【结果】成功克隆出绵羊FZD 1基因CDS区,序列全长为1941 bp,编码646个氨基酸。绵羊FZD1氨基酸序列与山羊相似性最高,为99.5%,与人的相似性最低,为96.7%;系统进化树结果显示,绵羊FZD1与山羊亲缘关系最近,与人亲缘关系最远。FZD1蛋白含有7个跨膜结构域,42个磷酸化位点和2个N-糖基化位点,主要分布在细胞膜上。FZD1蛋白二级结构预测结果显示,无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角分别占48.30%、35.15%、15.02%和1.55%,与预测的三级结构一致。实时荧光定量PCR结果显示,小尾寒羊FZD 1基因在肌肉和皮肤组织中的表达量显著高于新吉细毛羊,在心脏和肺脏中的表达量显著低于新吉细毛羊(P<0.05)。FZD 1基因在2个品种羊的肺脏和皮肤中的表达量均最高,且显著高于其他组织(P<0.05)。测序结果及HRM验证显示,FZD 1基因第1273和1276 bp位点处存在2个SNPs(g.9443455和g.9443458),这2个SNPs为完全连锁不平衡状态,仅存在2种单倍型,2个SNPs位点均为中度多态。【结论】FZD 1基因CDS全长1941 bp,编码646个氨基酸。FZD1蛋白作为位于细胞膜上的七跨膜受体蛋白,存在42个可能的磷酸化位点,推测FZD1的信号传导是通过磷酸化和去磷酸化进行的;FZD 1基因在小尾寒羊的皮肤组织中表达量最高,提示FZD 1基因可能参与毛囊发育的调控。