草莓MYB类转录因子FaMYB5基因的克隆与表达分析

以丰香草莓(Fragaria×ananassa cv.Toyonaka)为试材,通过同源克隆技术获得FaMYB5基因全长编码序列,运用生物学软件对该序列进行相关生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR方法对FaMYB5基因在果实不同发育阶段的表达模式进行研究。FaMYB5基因的cDNA全长为822 bp,编码273个氨基酸,蛋白质分子量为29.159 ku,等电点为5.709,与森林草莓的Fv MYB5同源性达95.7%。实时荧光定量PCR分析显示,随着果实发育成熟,FaMYB5基因的表达逐渐上升。在果实的小绿期(SG),FaMYB5基因的表达量最低。但是在白果期(WT)出现1个降低的峰值,其表达量略高于小绿期,草莓果实开始转红时其表达量又逐渐上升,在果实全红期(FR)达到最大。结果获得了丰香草莓MYB类转录因子FaMYB5基因的cDNA全长,其表达存在差异。

利用VIGS技术研究草莓FaMYB5的功能

以‘丰香’草莓(Fragaria×ananassa‘Toyonaka’)为材料,采用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced Gene Silencing,VIGS)对果实中类黄酮化合物代谢相关转录因子基因FaMYB5进行沉默,并对沉默后果实类黄酮化合物代谢途径相关的结构基因和其他转录因子基因表达量进行半定量RT-PCR及RT-qPCR分析。并分别采用HPLC和香草醛—硫酸比色法对沉默后果实中花青素苷和原花青素含量进行测定。成功构建了pTRV2-FaMYB5的VIGS沉默载体,并建立了草莓果实VIGS沉默体系,FaMYB5基因沉默效率达60%;FaMYB5基因沉默处理与阴性对照相比,草莓类黄酮化合物代谢途径相关结构基因和转录因子表达量均发生改变,其中FaMYB9、FaLAR、FaDFR、FaANR表达量显著增加,从而导致果实中原花青素含量增加;而花青素合成相关基因FaANS的表达量减少1/2,FaMYB10表达量变化并不显著。此外,bHLH家族的转录因子基因FabHLH3和FabHLH3Δ随着FaMYB5的沉默表达量显著下降,而FaGL3显著升高。结果进一步证明FaMYB5转录因子对草莓类黄酮化合物代谢途径中的原花青素合成途径起负调控作用。

草莓FaMYB5基因原核表达的响应面优化

利用中心组合设计(CCD)探究p ET-32a(+)-Fa MYB5融合蛋白原核表达的最优条件。以不同的诱导温度、诱导时间、菌液初始浓度和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为4个考察因素,以可溶性蛋白含量为考察指标,在大肠杆菌中表达p ET-32a(+)-Fa MYB5融合蛋白,采用玻璃珠法破菌,提取蛋白质后通过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定表达产物。经响应面优化后,在37℃培养工程菌至菌液OD600=0.74后,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.40 mmol/L,在25.51℃条件下诱导培养8 h,可获得最高产量的可溶性目的蛋白,为128μg/m L。最优表达条件的获得,为后期纯化该可溶性蛋白和鉴定Fa MYB5蛋白与顺势作用元件的作用情况提供了一定的理论依据。