一株人源性抗HBsAg抗体Fab片段的筛选及序列分析

一株人源性抗ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ片段的筛选及序列分析高辉高磊纪宗玲路凡陈南春陈苏民余宙耀张宜俊尤玉琴粟宽源（第四军医大学生物化学教研室，西安７１００３１空军广州医院全军肝病中心）乙型肝炎是我国常见的传染性疾病，目前尚无特效的治疗手段。研究发...

抗乙型肝炎表面抗原Fab片段联合抗细胞核单抗为载体的肝癌放射免疫治疗实验研究

目的探讨核素标记人源化抗(乙型肝炎)乙肝表面抗原Fab片段(抗HBsAgFab)联合核素标记抗细胞核单克隆抗体(chTNT)瘤内注射治疗荷人肝癌移植瘤裸鼠的可行性和优越性,为临床应用核素标记多种不同性质的单克隆抗体进行放射免疫治疗肝癌提供实验依据。方法荷瘤裸鼠分为五组,分别瘤内注射131I-抗HBsAgFab、131I-chTNT、131I-抗HBsAgFab联合131I-chTNT、131I-无关抗体(131I-IgG)及PBS。治疗后行SPECT显像观察标记抗体在肿瘤内的浓聚,并测量肿瘤大小变化,计算肿瘤抑制率。结果研究发现2种标记抗体联合应用组的肿瘤抑制率为73.09%,明显高于131I-抗HBsAgFab组的47.8%和131I-chTNT组的54.26%。联合应用组标记抗体在肿瘤组织/非肿瘤组织内的放射活度比值(T/NT值)大于单独应用组。结论131I-抗HBsAgFab联合131I-chTNT瘤内注射放射免疫治疗可增加标记抗体在肿瘤组织内的浓聚,并能提高放射免疫治疗效果。

一步亲和纯化制备基因工程人源抗HBs单克隆抗体Fab片段

目的：探索亲和纯化人源单克隆抗体片段的简便实用方法。方法：应用自制的抗人免疫球蛋白片段抗体（Ａｎｔｉ－Ｆａｂ）与链球菌蛋白Ｇ亲和胶（Ｇａｍ ｍ ａ Ｂｉｎｄ）交联制备亲和层析柱，用一步法从工程菌培养上清中纯化人源抗ＨＢｓ单克隆Ｆａｂ 片段。经依沙吖啶沉淀、离子交换、分子筛纯化人混合血清提取ＩｇＧ组分，木瓜酶处理后分离、纯化出Ｆａｂ，免疫绵羊制备高效价抗血清。用Ｇａｍ ｍ ａＢｉｎｄ 一步纯化出抗血清中的ＩｇＧ组分，再将该ＩｇＧ经交联剂与Ｇａｍ ｍ ａ Ｂｉｎｄ 交联后制成亲和胶。人源抗ＨＢｓ阳性菌培养上清与亲和胶共育后装柱，ＰＢＳ洗去非特异结合蛋白，再用５ ｍ ｏｌ／Ｌ氯化锂洗脱特异Ｆａｂ。结果：聚丙烯酰胺电泳纯化产物显示，纯化后的抗体片段在电泳中形成单一区带，达到电泳纯；用酶标抗Ｆａｂ 抗体免疫印迹结果证明，电泳显示的单一区带为Ｆａｂ 蛋白区带；抗原特异Ｄｏｔｂｌｏｔ检测表明，该法制备出的Ｆａｂ 保持了抗原结合活性。结论：本实验建立的一步亲和纯化法具操作简便、纯化快速和高效的特点，是人源性单克隆抗体Ｆａｂ

嵌合抗CD_(20)抗体Fab片段在大肠杆菌中表达及活性鉴定

目的 :构建抗CD2 0 嵌合抗体Fab片段表达载体 ,并在大肠杆菌中进行高效可溶性分泌表达。方法 :利用PCR方法从抗CD2 0 单链抗体 (ScFv)表达载体上扩增抗CD2 0 抗体轻链可变区基因 (VL)、重链可变区基因 (VH) ,然后将VH、VL 基因重组到Fab表达载体pYZF中 ,构建抗CD2 0 Fab表达载体pYZF1cd2 0 ,并在 2 7C7菌中高效表这。结果 :经Fab表达载体转化的 2 7C7菌株 ,进行表达培养 ,经分离纯化获得具有CD2 0 特异结合活性的Fab片段 ,竞争性免疫荧光抑制实验表明 ,表达产物Fab片段能竞争性抑制鼠源性抗CD2 0 抗体HI47和CD2 0 表达细胞Raji细胞结合。结论 :在大肠杆菌中高效可溶性分泌表达有活性的抗CD2 0 嵌合抗体Fab片段。

生物工程技术制备人源抗-HBs Fab片段

目的:用生物工程技术制备人源性抗-HBs F-ah。方法:将从抗体文库中筛选出的人源抗-HBs Fab基因克隆人pBAD/gⅢA载体,进而转化Top10大肠杆菌。对重组质粒菌发酵表达后,利用Ni-NTA-Agarose螯合层析柱纯化周质腔可溶性Fab 蛋白。对所得包涵体依次变性、溶解、纯化后,利用透析进行复性。用Western blot检测Fab蛋白的特异性,Dot blot测定其生物学活性。结果:经Ni-NTA-Agarose柱纯化的周质腔可溶性Fab蛋白,有较好的生物学活性,并且总量达到80mg/L。对所获包涵体进行透析复性后,也可得到少量有活性的蛋白,但比例很小。结论:用pBAD/gⅢA-Top10表达系统表达人源抗-HBs Fab片段,发酵培养后,经有效纯化可得到生物学活性较好的可溶性蛋白,为人源抗-HBs Fab片段的大量制备提供了有效手段。

人源性抗HBsAg单克隆抗体Fab片段的制备及其纯化

目的：制备人源性重组ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ片段。方法：采用固相ＨＢｓＡｇ，从已建立的人源性抗体组合文库中筛选针对ＨＢｓＡｇ的抗体子文库，并转入大肠杆菌中表达。反复冻融细菌，获得可溶性Ｆａｂ片段。制备羊抗人ＩｇＧＦａｂ抗体亲和层析柱、纯化Ｆａｂ片段。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及点印迹法分析鉴定纯化后Ｆａｂ片段的纯度及结合ＨＢｓＡｇ的能力。结果：蛋白印迹显示转化后的细菌内有可溶性Ｆａｂ片段的表达。纯化后的Ｆａｂ片段达免疫纯，并具有特异性结合ＨＢｓＡｇ的能力。结论：该研究为人源性抗ＨＢｓＡｇＦａｂ用于临床治疗打下基础。

人源性抗HBsAg单克隆抗体Fab片段的表达与纯化

对已筛选到的人源性抗ＨＢｓＡｇ特异性噬菌体抗体基因文库进行表达研究，将特异性噬粒转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，反复冻溶法制备可溶性Ｆａｂ片段。免疫印迹实验表明大肠杆菌质周腔内有可溶性Ｆａｂ片段的表达。制备羊抗人ＩｇＧＦａｂ抗血清、建立抗人ＩｇＧＦａｂ抗体－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析柱，纯化Ｆａｂ片段。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示纯化的Ｆａｂ达免疫纯。

^（211）At标记抗胃癌单抗3H11及其Fab片段在荷人胃癌裸小鼠体内的分布

利用ＨＰＬＣ和ＥＬＩＳＡ法对￣（２１１）Ａｔ－３Ｈ１１的分析鉴定表明，间接亲核标记法得到的产品具有３Ｈ１１的天然性和纯度，并保持其免疫活性。￣（２１１）Ａｔ在荷瘤裸小鼠体内分布的结果表明，￣（２１１）Ａｔ－３Ｈ１１Ｆａｂ和￣（２１１）Ａｔ－３Ｈ１１与胃癌细胞有明显的特异亲合力，注射药物３ｈ后，其胃癌摄取率（％／ｇ）分别为９．４８±０．６５和４．９１±２．０５，前者的Ｔ／ＮＴ值在１２－１４ｈ左右明显大于后者。

利用亲和柱分离酶切产物制备抗体Fab片段

一个IgG型的抗体由两个Fab片段和一个Fc片段组成。Fab片段与整个抗体分子相比体积更小，从而更容易穿过细胞表面，实现细胞内检测；同时Fab片段去除了Fc片段的干扰，有助于避免在检测中出现假阳性的问题。制备Fab片段，可以使用胃蛋白酶将IgG类的抗体切割为（Fab^2）2片段以及许多小的片段，或是使用木瓜蛋白酶将抗体切割为两个Fab片段以及一个Fc片段。

人抗乙型肝炎表面抗原Fab片段的表达及活性鉴定

人抗乙型肝炎表面抗原Ｆａｂ片段的表达及活性鉴定２００００３上海第二军医大学长征医院范列英，韩焕兴，胡东平，孔宪涛关键词ＨＢｓＡｇ，Ｆａｂ片段，噬菌体抗体中国图书资料分类号Ｒ５１２．６２噬菌体抗体技术不仅能大量制备人源性单克隆抗体，而且为制备其他的具有...

人源乙型肝炎病毒表面抗原抗体Fab片段与IFN-α融合蛋白表达载体的筛选

目的探讨如何在无药物抗性改变；无转化细胞生物指示系统改变的情况下准确快速地筛选出人源抗乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗体Ｆａｂ片段／ＩＦＮ－α融合蛋白原核表达载体。方法在 ＩＦＮ－α基因两端加上 ＸｂａⅠ酶切位点后用 ＰＣＲ法扩增，再重组入以抗体库技术筛选得到的人源抗ＨＢｓＡｇ－Ｆａｂ片段表达载体的相应位点上，构建 ａｎｔｉ－ＨＢｓＡｇ－Ｆａｂ／ＩＦＮ－α融合蛋白表达载体。取 ＰＣＲ扩增得到的 ＩＦＮ－α ＤＮＡ，用地高辛标记系统进行化学标记，制备 ＩＦＮ－α ＤＮＡ探针。取构建的融合蛋白表达载体转化受体菌．增菌后，以溶菌酶加煮沸法批量制备载体 ＤＮＡ，点样于硝酸纤维膜上， ８０℃烤２ｈ，预杂交液 ４２℃，２ｈ膜预杂交，标记探针 ４２℃， ４ｈ杂交，洗膜后用酶标抗地高辛抗体显色。同时设单纯人源抗 ＨＢｓＡｇ－Ｆａｂ片段表达载体为阴性对照， ＩＦＮ－α质粒为阳性对照。阳性克隆再以 ＳａｃＩ和 ＸｂａⅠ酶切，琼脂糖电泳鉴定。结果４０株转化细胞中筛选出７个阳性克隆，酶切鉴定显示两者符合率达１００％，成功地筛选出了ａｎｔｉ－ＨＢｓＡｇ－Ｆａｂ／ＩＦＮ－α融合蛋白表达载体。结论人源ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ片段／ＩＦＮ－α融合蛋白表达载?

抗人小细胞肺癌单抗2F7人-鼠嵌合Fab片段基因的构建和表达

目的 :通过基因工程抗体改造获得具有与人小细胞肺癌有特异性反应的人 鼠嵌合抗体 2F7Fab片段。方法 :采用RT PCR技术从抗人小细胞肺癌单克隆抗体 2F7杂交瘤中克隆该抗体的重、轻链可变区基因 ,将 2F7单抗的重、轻链可变区基因装入带有人恒定区基因的表达载体pSW1 Fab中 ,构建得到pSW1 2F7Fab ,转化受体菌E .coilXL1 Blue ,IPTG诱导表达 ,经Westernblot和ELISA鉴定表达蛋白的活性。结果 :从抗人小细胞肺癌单克隆抗体 2F7杂交瘤中克隆获得了抗体重、轻链可变区基因。测序证实 2F7单抗的重链 (VH)可变区基因全长 36 2bp ,编码 12 0个氨基酸 ;轻链 (VL)可变区基因全长 319bp ,编码10 5个氨基酸。构建的 2F7人 鼠嵌合Fab表达载体诱导后获得了目的蛋白的表达 ,主要分泌在菌液的上清中 ,表达量较高且稳定 ,具有与NCI H1 2 8细胞特异性结合的活性。结论 :构建和表达了抗人小细胞肺癌单抗 2F7人 鼠嵌合Fab片段 ,表达产物具有与抗原结合的特异性 ,为进一步研究和应用打下了基础。

基因工程人抗体Fab片段的纯化及鉴定

目的 通过亲和层析的方法纯化基因工程人抗体Fab(Fragment,antigenbinding)片段。方法 对可以表达人抗体Fab的菌种进行诱导 ,冻融裂菌离心收集上清 ,进行亲和层析并对纯化前后的样品进行电泳分析及Westernblot检测。结果 SDS -PAGE电泳显示纯化品在还原、非还原条件下均为单一条带。Westernblot分析层析前抗体Fab片段还原的分子量在 2 .4× 10 4 左右 ,非还原的分子量约为 4.8× 10 4 ,而经过亲和层析后 ,在凝胶电泳上纯化品在还原、非还原条件下在相应位置上均显示单一蛋白带。结论 我们可以经过亲和层析 。

Dig-McAb Fab片段逆转猴严重地高辛中毒及其对药物动力学影响的观察

用Dig-McAb (digoxin-specific monoclonal antibody,地高辛单克隆抗体)Fab片段和IgG分别救治猴严重地高辛中毒成功。对照猴用无关McAb救治则短时内死于心室颤动。救治成活猴血清地高辛含量于Dig-McAb生效时,成倍增高且半衰期延长。Fab片段治疗后血中无相应抗抗体存在。表明Dig-McAb Fab片段是解除猴严重地高辛中毒之安全、速效而可靠的解毒剂。

单抗Fab片段与抗癌抗生素C1027偶联物对裸鼠移植人肝癌的治疗作用

抗人肝癌单抗3A5用氯化汞合木瓜蛋白酶消化,经SDS-PAGE、ELISA方法检测证实得到Fab活性片段。单抗3AS及Fab片段与抗癌抗生素C1027偶联,得到3A5-C1027和Fab-C1027偶联物。克隆生成测定对肝癌细胞具有极强的杀伤作用,C1027、3A5-C1027和Fab-C1027的IC50值分别为6.5 x10^(-16)、4.2×10^(-14)M和8.6×10^(-16) M。 Fab-C1027对人咽上皮癌细胞与靶细胞的杀伤活性相比,两者相差32倍,呈选择性杀伤作用。观察C1027、Fab-C1027对移植人肝癌裸鼠的治疗作用,其抑瘤率分别为59％和85％。在可耐受剂量下,C1027对人肝癌有明显的抑制作用,而Fab-C1027显示更强的抑制作用。

^(99m)Tc标记抗人肝癌单抗Fab片段修饰物在荷人肝癌裸鼠模型中的放射免疫显像

研究抗人肝细胞癌单克隆抗体Ｆａｂ片段修饰物的９９ｍＴｃ标记方法。用２亚氨基噻吩盐酸盐（ＩＴ）修饰ＨＡｂ１８Ｆａｂ片段。用９９ｍＴｃＧＨ转络合法标记ＩＴＦａｂ，测定标记物的放化纯度及生物活性，进行荷人肝癌裸鼠模型的放射免疫显像。结果：纸层析法测得标记率为５０％～８０％，体外细胞结合法测定免疫活性为３０％～４０％。荷人肝癌裸鼠模型尾静脉注入９９ｍＴｃＩＴＦａｂ后４～８小时，肿瘤区放射性有浓聚，１２～２２小时浓聚最多，Ｔ／ＮＴ值为５１８～７４８。因此，９９ｍＴｃＩＴＦａｂ可特异性浓聚于荷人肝癌裸鼠模型中，可能成为肝癌放射免疫显像的有效显像剂。

人源化抗Siglec-9抗体Fab片段的制备及鉴定

目的:构建人源化抗Siglec-9抗体Fab段原核表达质粒,表达、纯化此抗体以及特性分析,并初步探讨此抗体的生物学功能。方法:利用聚合酶链式反应(PCR)分别获得抗体轻链和重链的可变区及恒定区,经重叠延伸PCR连接,酶切后与原核表达载体p ETDUET-1重组,转入表达感受态Escherichia coli BL21中,通过蛋白纯化系统AKTA和His-trap Lambda Fab纯化。使用SDS-PAGE、ELISA以及Western blot鉴定和分析。采用实时荧光定量PCR初步检测抗Siglec-9抗体Fab段对炎性细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8的mRNA表达量的影响。结果:成功获得抗体轻链和重链,构建人源化抗Siglec-9抗体Fab段原核表达系统,经SDS-PAGE、Western blot、ELISA检测证实抗Siglec-9抗体Fab段与Siglec-9抗原特异性结合。抗Siglec-9抗体Fab段可抑制炎性细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8的mRNA表达量。结论:人源化抗Siglec-9抗体Fab段进行了原核系统表达、纯化和鉴定,并初步验证可抑制炎性细胞因子的mRNA表达量,为进一步研究该抗体的生物学特性及应用奠定基础。

抗体Fab片段的表达与应用研究进展

目前,抗体Fab片段在癌症、病毒感染和炎症等疾病的诊断治疗中越发重要,占抗体市场份额逐渐上升。相对于全长抗体,抗体Fab片段具有无须N糖基化、可用原核系统进行表达、分子小、免疫原性低等优势,使之成为研究的热点。大肠杆菌由于遗传背景清晰、使用广泛、生产成本低,因而常作为原核表达宿主。本文综述了大肠杆菌系统抗体Fab片段产量低的解决方法、Fab抗体的临床应用,并结合当前研究现状展望了Fab抗体生产的研究方向。

嵌合性抗ROR1抗体Fab片段的制备及鉴定

目的:构建嵌合性抗ROR1抗体Fab片段原核表达载体,初步探讨该抗体的生物学特性。方法:利用小鼠免疫和细胞融合,选取阳性克隆细胞株,在此基础上,运用基因工程技术扩增得到抗体轻链和重链,经酶切后与原核表达质粒pETDUET-1连接,构建重组表达质粒,将该重组质粒转入E.coli BL21中表达、纯化,SDS-PAGE、Western blot及ELISA对该抗体进行鉴定和分析,流式细胞术及免疫荧光初步检测该抗体与卵巢肿瘤细胞的特异性结合能力。结果:筛选出分泌抗ROR1抗体的杂交瘤单克隆细胞株,在此基础上,成功扩增抗体轻链和重链并构建嵌合性抗ROR1抗体Fab段原核表达载体,经检测证实抗ROR1抗体Fab段可与ROR1抗原和卵巢肿瘤细胞特异性结合。结论:初步验证嵌合性抗ROR1抗体Fab片段可与卵巢肿瘤细胞结合,为进一步探究抗体肿瘤靶向治疗奠定了基础。