HPLC法测定荞麦不同种不同部位槲皮素和山柰酚的含量

目的:采用HPLC法测定荞麦不同种不同部位槲皮素和山柰酚的含量。方法:色谱柱:DIKMA diamonsil(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脱;检测波长:260 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:25℃。结果:苦荞不同部位槲皮素含量为:种子(6.12 mg/g)>叶(1.47 mg/g)>茎(0.34 mg/g),根中未检测到;山柰酚只在种子(0.42 mg/g)和西荞1号叶(0.09 mg/g)中检测到;甜荞根(0.12 mg/g)、茎(0.17 mg/g)、叶(0.32 mg/g)和种子(0.12 mg/g)中均检测到较低含量的槲皮素,未检测到山柰酚;苦荞根、茎和叶中的槲皮素和山柰酚总含量和平均含量都高于甜荞;同一产地不同栽培品种苦荞中槲皮素和山柰酚含量差异不大,甜荞未检测到。结论:该方法方便快速,结果准确,可为荞麦及其产品的质量评价提供依据。

苦荞麦中芦丁的正交提取工艺及HPLC检测研究

采用芦丁的最大吸收波长510nm为指标,以索氏回流法进行正交试验;对提取物进行高效液相色谱法检测,结果表明:其最佳工艺参数为乙醇浓度60%vol,乙醇体积150mL,回流时间1.5h,超声时间40min,此条件下芦丁提取率0.95%。

苦荞FtWRKY28基因克隆及其在低磷与激素诱导下的表达分析

[目的]WRKY转录因子参与植物对低磷胁迫反应的调控。基于前期苦荞在低磷胁迫下的转录组数据,克隆FtWRKY28基因,预测基因及其编码蛋白的序列结构特征,分析基因在各器官中以及在低磷和激素处理下的表达模式、蛋白的亚细胞定位与转录激活活性,为阐明基因的生物学功能奠定基础。[方法]基于苦荞基因组数据库注释设计特异引物,用逆转录PCR从低磷处理的苦荞根RNA样中克隆FtWRKY28的完整编码序列,用生物信息学方法分析基因与蛋白的结构以及同源蛋白的进化关系,用实时荧光定量分析基因的表达模式,用拟南芥原生质体瞬时表达体系分析蛋白的亚细胞定位,用酵母单杂交分析蛋白的转录激活活性。[结果]FtWRKY28的完整编码序列长876bp,编码1个含291个氨基酸、有1个WRKY结构域、锌指结构域为C2H2型的蛋白,归属WRKY家族Ⅱ组。FtWRKY28绝大部分定位于细胞核,具有转录激活活性。FtWRKY28在根中表达水平最高,受低磷、吲哚乙酸、赤霉素3和6-苄氨基嘌呤显著诱导。[结论]FtWRKY28具有转录因子的基本结构与生物化学特征,可能通过生长素、赤霉素、细胞分裂素信号网络的交互作用,调控苦荞在低磷胁迫下的响应过程。

99份苦荞主要农艺性状评价与筛选

为了对苦荞的主要农艺性状进行综合评价,筛选优质苦荞品种,以99份苦荞(国外51份、国内48份)为试验材料,通过变异分析、相关分析和综合得分F值等方法对99份苦荞的11个农艺性状进行分析。结果表明:苦荞11个农艺性状间存在较大变异,变异系数均大于0.1;单株粒重、单株粒数、千粒重和株高与籽粒产量呈极显著正相关;主成分分析显示,前4个主成分的累计贡献率为73.234%,第一主成分中负有最高荷载的为单株粒数和单株粒重;聚类分析将99份苦荞分为6个类群,其中类群Ⅳ的18份品种性状优良,可作为核心种质资源。苦荞选育时应重点考虑单株粒数和单株粒重2个性状指标。综合聚类分析和综合得分F值筛选出23份高产优质苦荞,其中12份为国外引进品种。

UPLC-QQQ-MS/MS指纹图谱结合一测多评法的不同品种苦荞麦质量评价

目的建立18个品种苦荞麦Fagopyrum tataricum指纹图谱,并以芦丁为内标物,采用一测多评法(quantitative analysis of multi-components by single-marker,QAMS)同时检测苦荞麦中葫芦巴碱、表儿茶素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚和大黄素含量,以期对不同产地苦荞麦进行质量控制。方法采用超高效液相-三重四级杆液质联用技术(UPLC-QQQ-MS/MS),首次以一级全扫(Full-MS)和多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)2种采集模式相结合的方式建立UPLC-QQQ-MS/MS指纹图谱共有模式,采用夹角余弦法进行相似度评价。以ThermoFisher Accucore^(TM)C_(18)色谱柱(100 mm×3.0 mm,2.6μm);流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液,体积流量0.3 mL/min,柱温30℃,梯度洗脱。以芦丁作为内标物,建立苦荞中其他6种指标成分的相对校正因子(fs/x),从而计算各待测成分的量,并将QAMS计算值与外标法(external standard method,ESM)实测值进行比较,以验证QAMS的准确性和方法适宜性。运用聚类分析、主成分分析、加权分析等化学计量学分析手段建立苦荞麦综合质量优劣评价方法。结果建立了苦荞麦的UPLC-QQQ-MS/MS指纹图谱,在Full-MS扫描模式下标定了15个共有峰,各品种间相似度在0.399~0.973;同时以MRM扫描模式结合对照品对其中芦丁等7种指标成分进行了峰指认。以芦丁为内标物,与葫芦巴碱、表儿茶素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素、山柰酚和大黄素6种有效成分的建立的fs/x重现性良好,分别为0.283、1.338、0.654、1.162、8.509、0.709。且采用QAMS测定的18个品种苦荞麦中7种指标成分含量与ESM的实测值之间无显著性差异(P>0.05)。化学计量学分析结果表明,芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷和山柰酚是影响苦荞麦质量的主要潜在标志物,质量排序相对靠前的苦荞麦产区主要集中在海拔高、光照强、昼夜温差大的中国西南地区,而指纹图谱相似度差异较明显的荞杂2号、综甜2号和通荞1号排在后3位。结论所建立的指纹图谱结合QAMS简便可行,结果准确,化学计量学分析方法全面客观,可为苦荞麦品质评价和质量控制提供参考和依据。

苦荞麦的化学成分

目的研究苦荞麦的化学成分。方法利用硅胶S、ephadex LH-20等柱色谱方法分离化学成分,根据理化性质和波谱数据分析鉴定化合物的结构。结果从苦荞麦种子中初步分离得到5个化合物,分别鉴定为乌苏酸(ursolic acid,1)、7-羟基香豆素(7-hydroxycoumarin,2)、大黄素(emodin,3)、尿嘧啶(uracil,4)、原儿茶酸(protocatechuic acid,5)。结论化合物2为首次从荞麦属植物中分离得到,化合物1、5为首次从苦荞麦中分离得到。

四川省凉山州北部栽培苦荞麦的遗传多样性研究

用等位酶电泳技术测定了四川省凉山彝族自治州北部越西和甘洛2县的苦荞麦［Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.］17个栽培居群的遗传多样性和分化，结合农业生物学性状进行了分析。对7个酶系统的15个位点的检测表明，苦荞麦居群内的遗传多样性水平高于该州南部的苦荞麦和其他地区甜荞麦，每个位点的等位基因平均数为1.9，多态位点比率为52.1%，平均实际杂合度和预期杂合度分别为0.190和0.262， FST值为0.199，居群间存在着较明显的遗传分化，接近野生植物的平均水平。对苦荞麦种质资源保护提出了以下策略：“有翅荞”2个居群的多态位点比率P为60.0%，它们的实际杂合度均高于预期杂合度，分别为Ho＝0.260和Ho＝0.301，是遗传多样性最丰富的居群，应重点保护。此外，遗传多样性较高的2个“小米荞”居群和遗传位置独特的“秋苦荞”、“额曲苦荞”和“革洛苦荞”的3个居群也应加强保护。

苦荞叶总黄酮提取纯化工艺研究

[目的]合理开发利用苦荞麦生物资源,延伸苦荞产业链,提高其经济效益;探索适合苦荞叶黄酮工业化生产的工艺方法。[方法]以盛花期的苦荞叶为原料,采用超声波辅助法提取总黄酮,并通过大孔树脂吸附法进行纯化,对提取、纯化工艺进行了优化。[结果]总黄酮最佳提取工艺为:以60%的乙醇为提取剂,提取温度为72℃,料液比为1∶32g·mL^(-1),超声波处理时间为31min,超声波功率为101 W,此工艺条件下苦荞叶总黄酮得率为10.2523%;AB-8树脂对苦荞叶总黄酮纯化效果最好,最佳纯化工艺为:上样液pH为5,浓度为1.50g·L^(-1),流速为1.00mL·min^(-1),上样量为33mL·g^(-1)树脂,洗脱液为75%乙醇,洗脱液pH为5,流速为1.50mL·min^(-1),洗脱液用量为10mL·g^(-1)树脂,测得苦荞叶黄酮的回收率为77.01%,黄酮纯度为90.6%,是纯化前的3.02倍。[结论]苦荞叶中总黄酮的含量高,且易纯化;该提取、纯化工艺可满足工业化生产高效益、低成本、简单易操作的需求,为其工业化生产提供理论依据。

苦荞和甜荞查尔酮合成酶基因的克隆及序列比较

以苦荞品种‘西农9920’和甜荞品种‘西农9976’为材料,根据其它植物查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因DNA序列的保守区域设计的一对简并引物,进行PCR扩增,从2种荞麦基因组中克隆出了长度均为860 bp的CHS基因片段,对其进行回收、克隆,挑选阳性克隆测序;序列分析表明这2个片段含有CHS基因的N端和C端的结构域,分别为苦荞和甜荞的CHS基因片段,命名为FtCHS和FeCHS。对获得的2种荞麦CHS基因的DNA序列进行比较分析,发现两者间存在多达43处单碱基多态性,这些单碱基多态性可能是苦荞和甜荞种子中类黄酮含量差异的重要原因之一。苦荞和甜荞CHS与其它植物CHS的氨基酸序列的进化分析表明,其与同为蓼科的掌叶大黄和石竹科的满天星的同源性较近。

苦荞茎叶粉中总黄酮酶法提取工艺研究

目的研究苦荞茎叶粉中总黄酮酶法提取工艺。方法苦荞茎叶粉经纤维素酶处理后用水提取总黄酮,研究酶加酶量、解温度、酶解时间和pH值对总黄酮得率的影响。结果酶法提取的最佳工艺条件为酶解温度55℃,加酶量3.0μL,pH值6.5,酶解90min,再在90℃下提取3次,每次30min,总黄酮得率可达1.47%。结论纤维素酶适用于苦荞茎叶粉中总黄酮的辅助提取。

磁场对苦荞种子萌发过程中黄酮类物质的诱导效应

研究不同磁场强度诱导下,苦荞种子萌发过程中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮异构酶(CHI)及芦丁降解酶(RDEs)3种关键酶的酶比活力变化规律及与总黄酮含量的关系。结果表明:1)不同磁场强度对同一种酶的诱导效应不同:PAL酶比活力在磁场强度为0.3T时达到最高值;CHI酶比活力最高值出现在磁场强度为0.2T时;当磁场强度为0.3T时,RDEs酶比活力与对照相比无显著性差异;2)相同磁场强度对不同酶的诱导效应不同:强度为0.3T时,PAL酶比活力变化最大;强度为0.2T时,CHI酶比活力变化最大;3)当磁场强度为0.3T时,3种酶的协同作用使苦荞萌发物中总黄酮含量达到最高值(62.90mg/g);实验证实磁场对苦荞种子萌发过程中黄酮类物质的增加具有一定诱导效应。

苦荞麦种子化学成分研究

目的 :分离鉴定苦荞麦种子化学成分。方法 :80 %乙醇提取 ,聚酰胺及硅胶柱色谱分离 ;UV ,IR ,NMR ,MS确定其结构。结果与结论 :分离得到 4个化合物 ,分别鉴定为芦丁、槲皮素、山柰酚、山柰酚 -3 -0芸香糖苷。

苦荞麸皮黄酮抗氧化及抗肿瘤活性

以西南地区的两种苦荞麸皮为实验材料(重庆酉阳苦荞麸皮(T1);四川西昌苦荞麸皮(T2)),通过氧化自由基吸收能力实验(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)测定苦荞麸皮黄酮的化学抗氧化能力,采用人肝癌细胞HepG2为细胞模型,研究苦荞麸皮黄酮的细胞抗氧化活性(cellular antioxidant activity,CAA)及对HepG2细胞抗增殖活性。结果表明:T1和T2苦荞麸皮黄酮的ORAC值分别为(57.0±3.5)、(73.6±6.3)?mol TE/g。T1和T2苦荞麸皮黄酮的细胞抗氧化值分别为(44.4±5.2)、(52.5±2.7)?mol QE/100 g(PBS清洗);(32.9±3.2)、(30.9±2.2)?mol QE/100 g(不经PBS清洗)。在对HepG2细胞体外抗增殖活性研究实验中,通过与对照组细胞相比,发现当苦荞麸皮黄酮的质量浓度为21.9 mg/mL时,T1和T2苦荞麸皮黄酮对HepG2细胞增殖的抑制率分别约为51%和82%(P<0.01),二者相应的EC50值分别为(23.0±0.5)mg/mL和(13.7±0.1)mg/mL。因此,苦荞麸皮黄酮具有一定的体外细胞抗氧化和抗增殖的能力,可将苦荞麸皮作为此类功能性食品开发的原料资源。

鞑靼荞麦离体再生体系的建立

研究了苗龄、外植体、激素配比对鞑靼荞麦(Fagopyrum tataricum Gaertn.)离体培养的影响,初步建立了鞑靼荞麦离体再生体系.结果表明,鞑靼荞麦离体再生的最佳取材时间为苗龄6～8d;诱导愈伤组织的最适培养基为MS+2.0mg/L2,4-D+1.5mg/L6-BA,子叶诱愈率达75%左右,下胚轴诱愈率可高达86.62%;愈伤组织分化的最适培养基为MS+0.1mg/L IAA+2.0mg/L6-BA+1.0mg/L KT+0.5mg/L TDZ,来自下胚轴愈伤组织的分化率可达9.52%.下胚轴的诱愈率与分化率均高于子叶,更适于离体再生培养.培养基中加入AgNO3后,能有效降低褐化率.生根最适培养基为含有0.5mg/L NAA的1/2MS培养基,生根率在50%左右.TDZ在诱导鞑靼荞麦的愈伤组织分化出芽的过程中起到明显的促进作用,可提高分化率约20%.

盐胁迫下五个苦荞麦品种的耐盐性比较

以5个不同苦荞麦[Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn.]品种为试验材料,在100 mmol/L Na Cl胁迫下测定荞麦种子发芽率、幼苗根系活力、叶片质膜透性和Na+含量等指标,对5个苦荞麦品种种子萌发期和幼苗期的耐盐性进行了比较。结果表明,Na Cl胁迫下川荞1号种子发芽率和幼苗根系活力最高,幼苗叶片质膜透性和Na+含量最低;而川荞2号正好相反。说明在种子萌发期和幼苗期川荞1号的耐盐性最强,川荞2号对盐胁迫最敏感。

不同海拔高度对苦荞子粒营养成分的影响

分析了5个苦荞[Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn]品种在湖北省五峰县2个不同海拔高度生态试验点的子粒黄酮、氨基酸和多酚含量变化,旨在为摸索苦荞高效栽培模式,并为选育生态弱响应苦荞新品种奠定基础。结果表明,高海拔种植可提高苦荞黄酮、氨基酸与多酚的含量;相同海拔种植条件下,品种间的黄酮、氨基酸和多酚含量也存在显著性差异,西农9909在2个生态试验点的子粒黄酮含量分别极显著（P〈0.01）和显著（P〈0.05）高于其他品种;与海拔1 400 m种植相比,海拔780 m种植条件下品种间3种营养成分下降幅度均呈现不同程度的变化,其中黄酮含量各品种下降幅度较小,为2.86%~10.53%,多酚含量下降幅度为4.74%~28.57%,氨基酸含量下降幅度最大,为9.52%~77.59%;不同品种对海拔高度变化的敏感性也不同,在供试的5个品种中,SNKQ-1对生态环境因子变化钝感,而云荞2号对生态环境因子变化敏感。

烯效唑浸种对不同水分条件下苦荞生长的影响

以"黑丰一号"苦荞[Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn]为试验材料,采用不同浓度(0、40、80和120mg/kg)烯效唑浸种,探讨不同水分条件(正常供水、中度干旱和重度干旱)下烯效唑浸种对苦荞生长的抗旱效应。结果表明,烯效唑浸种降低了苗高,提高了苦荞的茎粗、叶面积、最大根长和根冠比;同时还提高了叶片相对含水量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量和根系活力。烯效唑处理降低了丙二醛(MDA)含量,从而降低了膜脂过氧化程度,提高了保护酶活性。采用80 mg/kg烯效唑浸种,在正常供水、中度干旱胁迫及重度干旱胁迫条件下,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性较对照均有不同程度的提高;苦荞株穗数、株粒数、百粒重较对照均有不同程度的提高。由此可见,80 mg/kg的烯效唑浸种可以提高苦荞的抗旱能力。

荞麦种子萌发期多种抗氧化酶活性的研究

通过研究荞麦种子萌发期(0～7 d)超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(ASP)四种抗氧化酶的酶活性变化,以及对自由基等的清除效果,分析荞麦种子内在抗氧化酶系统在萌发期对细胞膜结构的修复及保护作用。实验结果表明:荞麦种子在萌发期产生的活性氧、自由基等对四种抗氧化酶均有激活效应,其中超氧化物歧化酶(SOD)活性最先上升,其他三种酶随其后被激活,四种酶的氧化反应存在一定关联性和协同作用。苦荞的抗氧化酶活性高于甜荞。

苦荞水提液清除活性氧作用研究

用NBT光化还原法、Fenton反应法和钼酸铵显色分光光度法对苦荞[Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn]叶和茎水提液清除羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(·O2-)和过氧化氢(H2O2)的作用进行了研究。结果表明,苦荞叶和茎水提液具有较强的清除自由基能力,而且随水提液浓度增加其清除能力增强。其中叶的清除能力显著高于茎。

苦荞内生真菌产物EE-2抑制HepG2生长及诱导其细胞凋亡

目的研究苦荞内生真菌KQH-2代谢醇提物EE-2对人肝癌细胞的抑制作用及其作用机制。方法采用MTT法考察EE-2对人肝癌细胞HepG2体外增殖的抑制作用,显微镜观察EE-2对HepG2细胞形态的影响,琼脂糖凝胶电泳检测细胞DNA完整性,并利用流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡及细胞周期变化情况。结果用EE-2处理过的HepG2细胞,显微镜观察可见细胞脱壁圆缩,出现凋亡小体;细胞核降解。流式细胞仪检测发现,处理组的DNA直方图上有比对照组加强的SubG1峰,且可将HepG2细胞阻滞于G0/G1期。结论苦荞内生真菌KQH-2代谢醇提物EE-2可诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡,且具有细胞周期阻滞作用。