苦荞FtDELLA基因的克隆与表达分析

DELLA蛋白是赤霉素(GA)传导途径中的负调控蛋白,其在植物生长发育和胁迫响应中起着重要作用。该实验利用RT-PCR技术从苦荞中克隆到一个DELLA基因,命名为FtDELLA。克隆得到FtDELLA基因CDS全长1 452 bp,编码483个氨基酸。蛋白多序列比对显示,FtDELLA蛋白含有DELLA蛋白家族保守的DELLA保守结构域;系统进化分析表明,FtDELLA蛋白与拟南芥中AtRGA1亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,FtDELLA在苦荞不同组织部位均有表达,其中在茎和灌浆前的种子中表达量最高,在苦荞种子发育过程中,FtDELLA表达量呈逐渐下降趋势。在干旱胁迫下,FtDELLA的表达明显受到抑制,表明其可能是苦荞干旱胁迫应答的一个负调控基因。该研究结果为进一步研究FtDELLA在苦荞中的功能和作用机制提供了理论基础。

苦荞黄烷酮3-羟化酶基因F3H的克隆及序列分析

为提高黄酮代谢途径中的关键酶活性,增加苦荞黄酮类化合物的合成量,根据已知植物的F3H基因同源序列,采用RT-PCR和RACE结合的方法,克隆了苦荞黄酮代谢途径中关键酶基因F3H,命名为FtF3H(GenBank登录号:FJ456858)。序列分析结果表明,FtF3H基因长1369bp,编码367个氨基酸,该氨基酸序列及其cDNA序列与葡萄、牵牛F3H等的同源性约80%。二级结构预测表明,随机卷曲是FtF3H蛋白最大量的结构元件,而α-螺旋和β-片层则散布于整个蛋白质中;三维结构建模预测FtF3H蛋白具有铁离子结合位点及2-O-酮戊二酸结合位点等F3H蛋白典型结构。

苦荞全生育期芦丁积累与其生物合成途径相关基因表达分析

【目的】探究苦荞全生育期芦丁含量变化与其合成途径关键酶基因和调控因子MYB基因表达量之间的相关性,以期进一步明确苦荞植株体内芦丁生物合成的分子机制。【方法】以九江苦荞为试验材料,整个生育期分别在萌发期、子叶期、真叶期、盛叶期、现蕾期、盛花期、灌浆期和籽粒成熟期共8个时期取材(S1—S8)。采用RT-PCR方法,克隆获得与黄酮类代谢相关的MYB类转录因子基因。采用T-coffee软件进行氨基酸同源序列比对及保守结构域分析。与拟南芥黄酮类代谢相关的MYB转录因子及荞麦同源MYB转录因子序列比对,基于邻近法构建系统进化树;实时荧光定量PCR技术分析芦丁合成途径中5个关键酶Ft CHS、Ft F3H、Ft4CL、Ft FLS-like和Ft UFGT及上述克隆到的MYB转录因子在不同组织中的表达模式。基于高效液相色谱法(HPLC)测定全生育期取材组织的芦丁含量。同时采用相关性分析方法分析不同组织中芦丁含量变化与基因表达模式的相关性。转换上述数据为矩阵,采用欧式距离法构建共表达层次聚类图谱。【结果】克隆到2个MYB类转录因子,即Ft MYB7和Ft MYB9,其核酸序列长度分别为876和912 bp,分别编码291和303个氨基酸残基。氨基酸序列同源性比对分析结果表明,二者均具有典型的R2R3保守结构域,为R2R3类型的MYB转录因子。结合Nr数据库中17个苦荞和3个拟南芥黄酮类代谢相关MYB转录因子同源氨基酸序列构建系统进化树,结果表明这22个基因分成6大类群,其中Ft MYB7属于第II类群,Ft MYB9属于第IV类群,二者分属于不同类群,暗示这2个MYB转录因子可能涉及调控植物生长发育过程中不同功能类型。荧光定量结果显示,Ft MYB7在S3(真叶期)和S5(现蕾期)基因相对表达量最高,达到501和867倍;Ft MYB9在S1(萌发期)和S2(子叶期)相对表达量最高,分别为34和72倍。上述基因表达量与芦丁含量变化模式相关性分析表明,8个生长时期中,Ft4CL、Ft CHS、Ft F3H、Ft UFGT和Ft MYB7相对表达模式与芦丁含量变化幅度呈正相关,其相关系数分别为0.748、0.683、0.704、0.890和0.862。而Ft FLS-like和Ft MYB9与芦丁含量的变化幅度呈负相关,其相关系数分别为-0.442和-0.501。【结论】Ft MYB7和Ft MYB9转录因子在整个生育时期中表达模式存在明显差异。其中Ft MYB7可能在苦荞芦丁积累的过程中起到正调控作用,而Ft MYB9则为负调控作用。

苦荞查尔酮合酶基因FtCHS1启动子的克隆及分析

采用染色体步移技术,从苦荞(Fagopyrum tataricum Gaertn.)中克隆获得Ft CHS1基因5'端侧翼序列,共1038 bp,将其命名为PFt CHS1。生物信息学分析表明,PFt CHS1中A/T碱基含量为63.5%,含有4个可能的转录起始位点,分别位于起始密码子上游-684^-734、-692^-742、-920^-970、-929^-979 bp处,该序列包含TATA-Box和CAAT-Box等启动子核心元件以及与光、低温和激素应答等相关的功能元件。本研究进一步构建了PFt CHS1-p BI101植物表达载体,并瞬时转化拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)叶片,结果显示该序列可驱动GUS报告基因的表达。低温(4℃)和光照(UV-B)处理苦荞幼芽后,采用荧光定量PCR技术分析Ft CHS1基因的表达量,结果表明PFt CHS1可响应低温和紫外环境胁迫,从而引起Ft CHS1基因表达量发生变化。

苦荞类异黄酮还原酶基因(FtIRL)的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,从苦荞(Fagopyrum tatarium)中克隆得到类异黄酮还原酶基因(IRL)的开放阅读框序列(ORF),命名为FtIRL。序列分析表明:FtIRL含一个长942bp的ORF,编码313个氨基酸,其氨基酸序列与金荞异黄酮还原酶FcIFR(GenBank登录号ABV02071)同源性最高,达到97%;与其他植物IRL同源性为44%～73%。生物信息学分析表明:FtIRL推导的蛋白质含有典型的底物结合口袋和保守的NADPH结合位点,符合短链脱氢酶家族的结构特征。构建基于氨基酸的系统发育树表明,苦荞FcIFR虽然在氨基酸序列上与其他植物的异黄酮还原酶(IFR)有较高的同源性,但其生物学功能可能更接近落叶松脂醇还原酶(PLR)。

苦荞转录因子基因FtMYB1的克隆及序列分析

采用RACE-PCR技术,从苦荞花蕾克隆得到一个MYB基因(FtMYB1)。结果表明,FtMYB1基因DNA序列全长863bp(GenBank,JF313344),含两个内含子,内含子1长度为78bp(134～211bp),内含子2长度为74bp(342～415bp);cDNA序列全长711bp(GenBank,JF313345);开放阅读框(ORF)编码236个氨基酸,理论分子量26.9kDa,等电点6.33。序列比对及同源建模分析表明,FtMYB1蛋白与其他植物MYB结合域有高度的同源性,具有MYB同源蛋白的典型特征。

苦荞和甜荞二氢黄酮醇4-还原酶基因(dfr)的克隆及序列分析

采用同源基因克隆的方法,以苦荞和甜荞叶片为材料,提取总RNA,经RT-PCR扩增获得其二氢黄酮醇4-还原酶基因(dfr)cDNA序列,并通过T载体克隆后测序。序列分析表明,获得了苦荞和甜荞dfr的全长cDNA编码序列,其1026bp的全长开放阅读框(ORF)均编码341个氨基酸,并具典型的dfr结构特征和功能模块。同源性分析显示,苦荞和甜荞与其他植物的dfr基因核苷酸相似性为71%～98%;根据氨基酸序列构建系统进化树表明,二者与豆科、桑科和蔷薇科聚为一类。

苦荞麦WRKY15转录因子基因的分子克隆及其在叶斑病原与激素诱导下的表达分析

苦荞麦(Fagopyrum tataricum)叶斑病由链格孢(Alternaria alternata)和黑孢霉(Nigrospora osmanthi)引起。WRKY转录因子在植物免疫调节过程中发挥重要作用。研究苦荞麦FtWRKY15在叶斑病原与激素诱导下的表达,为深入解析FtWRKY15在植物抗病反应中的功能与机理奠定基础。采用逆转录PCR克隆获得了FtWRKY15的完整编码序列,长537 bp,编码178个氨基酸。FtWRKY15具有1个WRKY保守结构域,锌指类型为CCHH,属于WRKY IIc亚组。同源序列比对与系统进化分析表明,FtWRKY15与FtWRKY76的氨基酸序列同一性最高(64.0%),其次是藜麦(Chenopodium quinoa)WRKY50(52.3%)。原生质体瞬时表达分析表明FtWRKY15定位在细胞核中,与亚细胞定位预测结果一致。酵母单杂交实验表明FtWRKY15具有转录激活活性,其N端为酸性结构区(30~60位),富含丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化位点,可能负责转录激活。实时荧光定量PCR分析表明FtWRKY15在叶、花中的表达丰度最高,其次是茎、根,在果实中几乎无表达。病原N.osmanthi、A.alternata以及水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)激素显著诱导FtWRKY15的转录。上述结果提示,FtWRKY15具有转录因子的基本结构与生化特征,可能介导对苦荞麦叶斑病的防御反应。

苦荞查尔酮合成酶基因序列特征及分子进化分析

相比其他杂粮作物,苦荞(Fagopyrum tataricum)植株中含有高含量的黄酮类物质——‘芦丁’,因此对其生物合成途径中关键酶的研究具有十分重要意义。查尔酮合成酶(chalconesynthase)是黄酮类物质生物合成的第一个关键酶,本研究基于转录组数据库同源搜索方法,核酸序列拼接获得两个查尔酮合成酶基因,分别命名为FtCHS1(Genbank登录号:KJ130961)和FtCHS2(Genbank登录号:KJ139980)。生物信息学分析结果表明,这两个基因编码的蛋白序列有3个保守结构域,其结构域上包含3个活性位点,11个产物结合位点,5个乙酰辅酶A结合位点;同时系统进化树分析表明,22个蓼科植物中的查尔酮合成酶基因分成两个大类(Ⅰ和Ⅱ),苦荞中这两个基因分属两个大类。通过半定量和荧光定量PCR技术分析这两个基因组织特异性,结果表明两个基因在幼胚和花中表达量高于其他组织。本研究结果初步揭示了苦荞查尔酮合成酶基因的序列特征及表达模式,为进一步探索苦荞特有的芦丁生物合成途径相关基因资源,基因工程获得高芦丁含量苦荞品种奠定基础。

光照对药食同源植物苦荞麦种子中原花青素积累关键酶FtANR,FtLAR基因表达的影响

苦荞麦Fagopyrum tataricum作为重要的药食两用植物,由于种子中含有丰富的黄酮类成分,因而具有良好的清除自由基、抗氧化、抗衰老等作用。现有的苦荞麦黄酮类化合物研究大多集中在黄酮醇类化合物如芦丁的合成、调控以及积累上,但针对苦荞麦中原花青素类成分的代谢途径研究鲜有报道。该研究以原花青素代谢途径中关键的合成基因花青素还原酶（ANR）和原花青素还原酶（LAR）入手,通过挖掘苦荞麦转录组信息克隆了Ft ANR（F.tataricum ANR）,Ft LAR1（F.tataricum LAR1）,Ft LAR3（F.tataricum LAR3）。由于光在植物次生代谢物质形成与积累过程中发挥着重要作用,该研究试着探索不同光质（红光、蓝光、远红光、紫外光）对原花青素代谢途径中关键的合成基因ANR,LAR的表达影响。该研究发现红光对所克隆基因表达的影响呈现出与其他光相反的作用：Ft ANR,Ft LAR1在红光处理后基因的表达量有所下降,而其在蓝光、远红光、紫外光处理后基因的表达量是有所上调的;Ft LAR3在红光处理后基因的表达量有所上调,而其在蓝光、远红光、紫外光处理后基因的表达量是有所下降的。

苦荞麦叶斑病原诱导的FtWRKY39基因克隆、表达与生化特性分析

WRKY转录因子在植物抗病防御过程中发挥重要的调节作用。苦荞麦(Fagopyrum tataricum)叶斑病由链格孢(Alternaria alternata)、黑孢霉(Nigrospora osmanthi)引起。采用逆转录PCR方法,从接种A.alternata的苦荞麦叶RNA样品中克隆获得FtWRKY39基因的cDNA序列。FtWRKY39 cDNA长1037 bp,含有1个长为1029 bp的完整开放读码框,编码342个氨基酸。FtWRKY39具有1个典型的WRKY保守结构域,锌指类型为CCHC,归类于WRKY第Ⅲ组。FtWRKY39与苦荞麦WRKY12、藜麦(Chenopodium quinoa)WRKY41和甜菜(Beta vulgaris)WRKY41在氨基酸水平上的同源性较高,序列同一性分别为50.9%、44.6%、43.7%。原生质体瞬时表达分析表明,绝大部分的FtWRKY39定位在细胞核中,少量分布于细胞质内,与亚细胞定位预测结果一致。FtWRKY39的C端为酸性结构区,富含丝氨酸、苏氨酸磷酸化位点,提示它具有转录激活活性,酵母单杂交实验证实了这种推测。实时荧光定量PCR分析表明,FtWRKY39在根中的表达丰度最高,其次是果、花和叶,在茎中表达水平最低;Ft WRKY39受A.alternata和N.osmanthi以及3种重要的抗病相关激素——水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)显著诱导。上述结果提示,FtWRKY39具有作为转录因子的基本结构与生化特征,可能通过SA、JA/ET信号通路介导对苦荞麦叶斑病的抗性反应。

苦荞漆酶基因的克隆与生物信息学分析

利用RT-PCR技术从苦荞中克隆出2条漆酶(laccase)基因,运用生物信息学技术对2个基因序列进行分析,预测结构域、二级和三级蛋白结构,进行蛋白同源比对及进化树分析。结果表明,FtLAC-1基因序列开放阅读框为1695bp,编码564个氨基酸,FtLAC-2基因序列开放阅读框为1707bp,编码568个氨基酸。FtLAC-1和FtLAC-2蛋白预测分子量分别为61.41和62.47kDa,理论等电点分别为9.45和9.41,为亲水性蛋白,2个基因序列相似性较低,氨基酸序列同源性不高。qRT-PCR分析出其在苦荞不同组织器官存在差异性表达。结论为进一步探索FtLAC-1和FtLAC-2在苦荞薄果壳形成中的功能提供理论基础。