乌梅-防风药调控过敏性鼻炎Treg/Th17免疫平衡的分子机制研究

目的:探讨乌梅-防风药调控肥大细胞外泌体源性MMP9对过敏性鼻炎(AR)小鼠Treg/Th17免疫平衡的影响。方法:筛选乌梅与防风的潜在作用靶点,并与AR的风险基因取交集,GO分析与蛋白互作分析筛选出潜在作用靶点。建立AR小鼠模型,分离小鼠股骨中肥大细胞及外泌体。乌梅-防风药及外泌体治疗小鼠。评估各组小鼠行为学评分,检测小鼠鼻黏膜中Foxp3、RORγt的mRNA表达。敲减外泌体中MMP9表达后,观察AR小鼠的行为学评分和Foxp3、RORγt的mRNA表达。结果:生物信息学结果显示,乌梅-防风药可能通过肥大细胞外泌体源性IL-1β、MMP9作用于AR。相对于正常小鼠,AR小鼠Foxp3 mRNA表达降低,RORγt mRNA表达升高,MMP9表达升高(均P<0.05)。乌梅-防风药处理AR小鼠后,Foxp3 mRNA表达升高,RORγt与MMP9表达降低,但肥大细胞外泌体能进一步抵消乌梅-防风药的作用,敲减MMP9后肥大细胞外泌体作用减弱。结论:乌梅-防风药通过抑制骨髓源性肥大细胞外泌体源性MMP9调控AR小鼠Treg/Th17失衡。

防风-乌梅配伍对哮喘模型小鼠气道重塑的影响

目的:观察防风-乌梅配伍对哮喘模型小鼠气道重塑的影响,并探索其机制,为进一步研究中药配伍奠定基础。方法:70只BALB/C小鼠随机分为正常对照组、哮喘模型组、激素干预组、防风组、乌梅组、防风-乌梅组、防风-乌梅合激素干预组。以卵蛋白(OVA)建立哮喘模型。造模成功后连续用药干预7 d。防风组、乌梅组、防风-乌梅组、防风-乌梅合激素干预组分别于上午9∶00给予防风(3.082 5 g·kg-1·d-1)、乌梅(3.082 5 g·kg-1·d-1)、防风-乌梅(6.165 g·kg-1·d-1)、防风-乌梅(6.165 g·kg-1·d-1)药液灌胃,其余各组给予生理盐水灌胃;激素干预组、防风-乌梅合激素干预组分别于下午3∶00给予0.02%布地奈德雾化吸入,其余各组给予生理盐水雾化吸入。观察各组小鼠肺组织病理改变,测量支气管平滑肌厚度,ELISA法测定肺组织MMP-9、TIMP-1、IL-6及IL-8的含量。结果:防风-乌梅配伍可改善哮喘模型小鼠肺组织炎症,减少支气管平滑肌厚度,降低肺组织IL-6、IL-8、MMP-9、TIMP-1的表达及MMP-9/TIMP-1的比值(P<0.05或P<0.01),以防风-乌梅合激素干预组最佳,防风-乌梅组优于防风组和乌梅组。相关性分析提示IL-6、IL-8与MMP-9、TIMP-1显著相关。结论:防风-乌梅'相须为用'配伍可改善哮喘气道重塑,其机制可能与减轻支气管平滑肌肥厚、改善气道炎症、降低肺组织MMP-9、TIMP-1的表达及MMP-9/TIMP-1的比值有关。

药对防风-乌梅对肥大细胞分泌Th2类细胞因子的作用及机制研究

目的:药对防风-乌梅抑制肥大细胞系P815细胞分泌Th2类细胞因子的作用及机制,为该药对临床应用提供科学依据。方法:胰蛋白酶刺激P815细胞方法建立肥大细胞脱颗粒模型,用ELISA法观察药对防风-乌梅对肥大细胞分泌Th2类细胞因子IL-4、IL-13及相关信号通路蛋白Akt、ERK的影响。结果:药对防风-乌梅在体外可阻断肥大细胞IL-4的分泌,并抑制信号通路蛋白Akt、ERK的表达,与细胞模型组比较有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。结论:药对防风-乌梅抗哮喘机制可能与该药对通过抑制肥大细胞ERK和AKT蛋白,阻断肥大细胞分泌IL-4有关。

基于超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术（UPLC-Q-TOF）对防风乌梅药对在健康大鼠血清药物化学研究

目的:分析给予大鼠防风-乌梅药对后的入血成分及其代谢产物。方法:10只雌性大鼠分为防风-乌梅药对给药组和空白对照组,分别予防风-乌梅药对生药溶液和同体积纯水灌胃。给药4 d后,用固相萃取法提取含药血清及空白血清,用药材的乙腈提取液作为药材对照。色谱采用Angient Zorbax Eclipse Plus C8(3.0×100 mm,1.8μm)为色谱柱、0.1%甲酸溶液-乙腈梯度洗脱;质谱采用ESI源、质荷比(m/z)50~1200范围内正离子扫描模式。利用主成分分析结果和药材原型成分数据库对药对血中移行成分及代谢物进行鉴定。结果:防风乌梅药对原型入血成分3种(升麻素、汉黄芩素、升麻素苷)均来自于防风,另外有内源性物质有11种。结论:防风-乌梅药对给药后体内内源性物质较单独使用防风和乌梅任一药味均显著增加,提示药对对机体功能的影响强于单味药物。

基于网络药理学的乌梅-防风药对治疗过敏性哮喘作用机制研究

目的采用网络药理学方法研究乌梅-防风药对治疗过敏性哮喘的作用机制。方法借助药代动力学参数,采用中药系统药理学数据库(TCMSP)筛选乌梅-防风药对中活性成分及作用靶点。采用OMIM和AllerGAtlas数据库挖掘过敏性哮喘作用靶点,通过Cytoscape网络可视化软件构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络,进一步进行通路注释和基因富集分析。结果本研究筛选得到乌梅-防风药对有效成分15个,可调控IL-6、VEGFA、EGFR、CASP3等28个过敏性哮喘相关靶点,主要通过调控肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、白细胞介素(IL)17信号通路、核因子(NF)-κB信号通路、17型辅助T(Th17)细胞分化、缺氧诱导因子(HIF-1)信号通路共5条信号通路发挥治疗过敏性哮喘的作用。结论乌梅-防风药对通过多成分、多靶点、多通路协同作用发挥治疗过敏性哮喘的作用,为乌梅-防风药对生物效应机制的研究提供参考。

防风-乌梅含药血清对血小板衍生因子诱导人支气管平滑肌细胞增殖与细胞周期的影响机制研究

目的观察防风-乌梅含药血清对血小板衍生因子(PDGF)诱导人支气管平滑肌细胞(HBSMC)增殖及其对细胞周期的抑制作用,探索防风-乌梅配伍抑制气道重塑的机制。方法通过PDGF诱导的方式诱导HBSMC增殖;分别予大鼠灌胃防风、乌梅、防风-乌梅及生理盐水,制备药物血清;取4代对数生长期的HBSMC,将其分为空白对照组、细胞模型组、正常大鼠血清组、正常大鼠血清细胞模型组、激素干预组、防风血清组、乌梅血清组、防风-乌梅血清组,对细胞给予相应处理;CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,流式细胞检测细胞周期,Elisa技术检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)的浓度。结果防风-乌梅血清组降低细胞增殖的能力要优于单独使用防风血清组和乌梅血清组;防风-乌梅血清组能增加G0/G1期细胞比例,减少S期细胞数;防风-乌梅血清组降低TNF-α和IL-8浓度的作用优于单独使用防风血清组和乌梅血清组。结论防风-乌梅配伍能显著抑制HBSMC增殖,阻滞细胞周期进程,影响气道重塑,其机制可能通过抑制TNF-α、IL-8释放有关。

基于蛋白酶激活受体2表达研究药对防风-乌梅抗过敏的配伍机制

目的观察防风和乌梅配伍前后对肥大细胞脱颗粒以及蛋白酶激活受体2(PAR-2)表达的影响,为药对防风-乌梅抗过敏的研究提供实验依据。方法体外采用胰蛋白酶刺激小鼠肥大细胞株P815方法建立肥大细胞脱颗粒模型,运用RT-PCR、Western blotting、ELISA等技术,观察防风-乌梅配伍前后对肥大细胞分泌组胺、PAR-2 mRNA和蛋白表达的影响。结果防风-乌梅配伍后在体外抑制肥大细胞分泌组胺、PAR-2表达的作用明显增强,与细胞模型组比较有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。结论防风-乌梅配伍后抑制脱颗粒作用明显增强,下调肥大细胞PAR-2表达可能是药对防风-乌梅抗过敏的配伍机制之一。

防风乌梅含药血清对血小板衍生生长因子诱导气道平滑肌细胞迁移的影响

目的探讨防风-乌梅配伍对支气管哮喘气道重塑的影响及可能作用机制。方法 20只SD雄性大鼠随机分为正常组、防风组、乌梅组、防风乌梅组(防风∶乌梅=1∶1),每组5只。防风组、乌梅组、防风乌梅组分别给予相应生药15. 425、15. 425、30. 850 g/(kg·d)药液灌胃,正常组给予等量生理盐水灌胃,各组均每日3次。干预4天后制备含药血清。采用20 ng/ml血小板衍生生长因子诱导的方式促使人支气管平滑肌细胞(HBSMC)迁移模型。实验分为空白对照组、细胞模型组、正常血清组、正常血清细胞模型组、激素干预组、防风血清组、乌梅血清组、防风乌梅血清组,HBSMC以5×10^4/ml细胞密度接种于培养板,每组8个样本,各组加入10%相应血清干预,37℃、5%CO2培养。培养0、6、24 h时采用细胞划痕实验观察各组细胞迁移率,培养48 h后采用跨膜迁移实验观察跨膜迁移细胞数,ELISA法检测细胞上清液中基质金属蛋白酶9 (MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制剂1 (TIMP-1)浓度,计算MMP-9/TIMP-1值。结果与空白对照组、正常血清组比较,细胞模型组、正常血清细胞模型组6 h、24 h时细胞迁移率升高,48 h时跨膜迁移细胞数亦升高,细胞上清液中MMP-9浓度、MMP-9/TIMP-1值升高,TIMP-1浓度降低(P <0. 05)。与细胞模型组、正常血清细胞模型组比较,防风乌梅血清组、激素干预组细胞上述各指标均显著改善,并且优于防风血清组和乌梅血清组(P <0. 05)。结论防风-乌梅配伍能显著抑制人支气管平滑肌细胞迁移而影响气道重塑,优于单独使用防风或乌梅,其机制可能与抑制MMP-9/TIMP-1值有关。