携带Fas基因重组腺病毒治疗瘢痕疙瘩的体外研究

目的 应用成功制备的携带人 Fas基因的两种重组腺病毒 ,感染瘢痕疙瘩 (keroid,K)成纤维细胞 (fi-broblasts,FB) ,使其稳定高效地表达以替换原有无功能的 Fas蛋白 ,并恢复正常的重建后 Fas信号传导通道。 方法 腺病毒感染 KFB后 ,检测及比较两种腺病毒转染前后 ,KFB内 Fas蛋白的表达变化、蛋白功能以及细胞增殖 -凋亡状况。 结果 腺病毒感染后的 KFB均能稳定提高 Fas蛋白的表达 ,并且在 Fas单克隆抗体的诱导下可以发生明显的细胞凋亡。 结论 1构建的两种重组腺病毒 Ad- Fas在体外实验中能有效地提高 KFB蛋白的表达 ,并可以重建原来阻断的死亡信号传导通道 ;2细菌内重组腺病毒体外治疗效果更佳 ;3再次估证了 Fas基因突变与 K之间的联系 ,为 K基因治疗展示了一条新途径。

Fas配体基因对大鼠颈动脉损伤后血管中层平滑肌细胞密度的影响

目的:探讨腺病毒载体介导Fas配体(FasL)基因导入对大鼠颈动脉损伤后血管中层平滑肌细胞密度的影响。方法:实验分治疗组(Ad-FasL组)和正常对照组两组(Ad-βgal组),每组动物均为6只。利用重组腺病毒载体分别将Ad-FasL、Ad-βgal导入大鼠颈动脉球囊损伤的内膜,3、14d后观察其对血管中层平滑肌细胞密度的影响。结果:与正常对照组相比较,通过腺病毒载体介导导入FasL基因的被球囊损伤的大鼠颈动脉,3d后损伤血管中层平滑肌细胞密度降低,14d后血管中层平滑肌细胞密度恢复到正常水平。结论:FasL可抑制血管中层平滑肌细胞密度,从而抑制球囊损伤后的内膜增生。

Fas配体基因导入对大鼠颈动脉损伤后新生内膜的影响

目的 :探讨腺病毒载体介导 Fas配体 (Fas L)基因导入对大鼠颈动脉损伤后新生内膜的影响。方法 :利用重组腺病毒载体将 Fas L 导入大鼠颈动脉球囊损伤的内膜 ,14d后观察其对新生内膜形成的影响。结果 :通过腺病毒载体介导导入 Fas L 基因的被球囊损伤的大鼠颈动脉 ,与 Ad- β gal基因的对照组相比较 ,14d后损伤血管新生内膜 /中膜面积比降低了 73%(P<0 .0 1)。结论 :Fas L 可抑制新生内膜的增生。

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达。万法:将人源性的VEGF165 cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达。结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610 bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108pfu／ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达。结论:成功构建了表达人VEGF165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础。

携带野生型PTEN基因的重组腺病毒治疗子宫内膜癌的体外研究

目的:观察携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-PTEN)体外转染子宫内膜癌细胞后的表达,并探讨其对肿瘤细胞产生抑制增殖、诱导凋亡的作用及机制。方法:细菌内同源重组方法构建Ad-PTEN,体外转染PTEN基因突变的子宫内膜腺癌RL95-2细胞中,X-gal染色检测转染效率。应用RT-PCR、Western印迹、细胞免疫组化检测Ad-PTEN在RL95-2细胞中的转录及表达;应用细胞计数、MTT实验,观察Ad-PTEN对RL95-2细胞生长的影响;应用光镜、透射电镜观察外源性PTEN基因表达对RL95-2细胞形态学及超微结构的影响;应用流式细胞分析仪(FCM)检测Ad-PTEN对RL95-2细胞周期分布的影响、凋亡诱导作用及半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶casapase-3的激活。结果:外源性野生型PTEN基因经腺病毒介导成功转入RL95-2细胞,3种方法均检测出有PTENmRNA及PTEN蛋白的表达,当感染复数(MOI)为50时,体外转染效率达到100%。Ad-PTEN显著抑制RL95-2细胞生长并诱导其凋亡。此外,Ad-PTEN还能诱导RL95-2细胞周期G0/G1期阻滞以及caspase-3的激活。结论:重组腺病毒Ad-PTEN是高效的基因转移系统,能将PTEN目的基因转移到丧失该基因功能的子宫内膜癌RL95-2细胞中,对RL95-2细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导作用,其机制可能包括细胞周期G0/G1阻滞及caspase-3蛋白酶的激活。

重组腺病毒介导P21^(WAF1/CIP1)诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的体外实验研究

目的 :研究基因转移P2 1WAF1/CIP1过量表达对人脑胶质瘤细胞凋亡的影响。方法 :构建缺陷型重组腺病毒载体 :在CMV启动子控制下的人p2 1cDNA(Ad P2 1) ,其编码人P2 1蛋白。通过流式细胞仪、RT PCR进行P2 1表达检测 ;应用TUNEL法、荧光显微镜和流式细胞仪进行相关凋亡检测、分析。结果 :RT PCR检测 5株亲本胶质瘤细胞表达p2 1cDNA ,而流式细胞仪未检测到P2 1表达 ;Ad P2 1转染的胶质瘤细胞株均过量表达P2 1;在体外通过细胞形态学、分子生物学等检测均证实Ad P2 1能诱导胶质瘤细胞向终末分化并诱导细胞凋亡。结论 :基因转移P2

重组腺病毒介导Fas基因转染瘢痕疙瘩细胞并诱导其凋亡的实验研究

目的 制备含人Fas基因的重组腺病毒 ,感染瘢痕疙瘩成纤维细胞后 ,使其稳定高效地表达以替换原有无功能的Fas蛋白 ,并恢复正常的重建后Fas信号传导通道。方法 Fas基因自PcDNA3 1 Fas质粒中切取 ,应用PDC315载体系统构建携带Fas基因的重组腺病毒 ,感染瘢痕疙瘩成纤维细胞 ,检测Fas蛋白的表达及功能。结果 成功地构建了携带Fas基因的重组腺病毒 ,感染后瘢痕疙瘩成纤维细胞能稳定表达的有功能的Fas蛋白。结论 利用重组腺病毒转染可以重建被阻断的瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas死亡信号传导通道 ,并再次估证了Fas基因突变与瘢痕疙瘩之间的联系 。

携带Fas基因重组腺病毒治疗瘢痕疙瘩的体内实验研究

目的研究携带人 Fas 基因的两种重组腺病毒对瘢痕疙瘩的体内治疗效果。方法构建瘢痕疙瘩裸鼠模型,应用携带 Fas 基因的常规腺病毒 Ad-Fas(T)和细菌内承组腺病毒 Ad-Fas(B)注射及 Fas 单克隆抗体(FasMcab)辅助对植入裸鼠皮下的瘢痕疙瘩组织进行治疗。通过大体观察、常规病理及电镜观察检测瘢痕疙瘩组织的变化。结果单纯使用腺病毒注射的瘢痕疙瘩组织块体积仅轻度缩小。前期注射 Ad-Fas(B)或 Ad-Fas(T)后,应用 FasMcab 作为后续治疗,瘢痕疙瘩组织块均明显缩小,HE 染色证实瘢痕疙瘩组织结构遭到破坏,电镜观察发现细胞凋亡证据。结论重组腺病毒Ad-Fas(B)及 Ad-Fas(T)的瘢痕疙瘩基因治疗效果令人满意。为瘢痕疙瘩的治疗提供了新途径。

类固醇类激素联合携带Fas基因重组腺病毒治疗瘢痕疙瘩的体内实验研究

目的 应用成功制备的携带人Fas基因的两种重组腺病毒，联合类固醇激素进行瘢痕疙瘩的动物实验研究，判断携带人Fas基因的重组腺病毒与类固醇激素联合治疗瘢痕疙瘩的效果。方法 构建瘢痕疙瘩裸鼠模型。使用Ad-Fas（B），Ad-Fas（T）两种构建成功的腺病毒注射及其它辅助治疗手段，实施针对植入裸鼠皮下的瘢痕疙瘩组织的体内治疗方案。通过大体观察，常规病理及电镜观察检测瘢痕疙瘩组织块的变化。结果 ①单纯使用腺病毒注射后的瘢痕疙瘩组织块体积仅轻度缩小。②前期注射Ad-Fas（B）或Ad-Fas（T）后，使用类固醇激素作为后续治疗因素，其瘢痕疙瘩组织块均明显缩小。③使用腺病毒治疗后，能有效地减少曲安缩松的使用，从而减轻类固醇类激素治疗的副作用。结论 ①裸鼠为免疫缺陷动物，所以该结果并不能否认病毒的直接治疗作用，在免疫性动物体内直接注射腺病毒的治疗效果尚无结论。②重组腺病毒Ad-Fas（B）及Ad-Fas（T）的瘢痕疙瘩基因治疗的动物实验为瘢痕疙瘩的治疗展示了一条全新的途径。