肝片吸虫Fh8明显增强STEC的Stx1可溶性表达及Stx1单克隆抗体制备

志贺毒素1（Shiga toxin 1,Stx1）,系五聚体蛋白,是产志贺毒素性大肠杆菌（Shiga Toxin-producing Escherichia coli,STEC）主要的毒素因子,但Stx1体外极不易可溶性表达,旨在克隆和表达志贺毒素1（Shiga toxin 1,Stx1）A亚基,体外获得可溶性表达的Stx1,以研制单克隆抗体。生物信息学软件分析Stx1A亚基氨基酸序列,Stx1A1亚基N端为信号肽段,其C端高疏水性和低免疫原性。PCR扩增stx1A亚基73~759的687个核苷酸,与肝片吸虫Fh8基因串联,克隆到低温表达载体p ColdⅠ以构建重组菌,诱导表达重组毒素His-Fh8-Stx1A,SDS-PAGE分析蛋白表达形式。重组毒素His-Fh8-Stx1A免疫Balb/c小鼠,Sp2/0细胞融合筛选、制备阳性杂交瘤和单克隆抗体。PCR扩增Fh8和stx1a亚基并构建重组质粒p ColdⅠ-His-Fh8-stx1,重组蛋白在原核细胞中得到高效表达,且以可溶性形式存在于菌体胞浆中。以重组His-Fh8-Stx1A为免疫原,成功制备3株能稳定传代并分泌Stx1的单克隆抗体（Mc Ab）的杂交瘤细胞株,取其中1株成功制备高ELISA效价的腹水。Western Blot显示,纯化的单克隆抗体可与重组免疫原His-Stx1A和天然志贺毒素1发生特异性反应。本试验成功可溶性表达志贺毒素1A亚基,并获得多株单克隆抗体,为研制用于检测STEC的夹心ELISA和胶体金试纸条奠定理论基础。

肝片吸虫Fh8标签融合表达口蹄疫O型病毒结构蛋白

口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）的结构蛋白VP1难以实现体外的高效表达。本研究为获得良好免疫原性的VP1蛋白，选用肝片吸虫Fh8小肽段作为新型融合表达标签，构建重组Fh8-VP1免疫原，以期获得大肠杆菌中的高效表达。分别合成VP1的20440aa和129～169aa之间的核苷酸片段，并用2个甘氨酸（GG）连接2个片段，合成的核苷酸片段（△VP1）克隆入Fh8标签之后，构建重组菌BL21（DE3）／pCold I—Fh8-△VP1，SDS-PAGE分析蛋白表达形式，Westernblot方法检测重组His—Fh8-△VP1的抗原性。结果显示，成功构建重组质粒BL21（DE3）／pCold I—Fh8-△VP1，并在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高效表达，且以包涵体形式存在于菌体蛋白，可与猪源FMDV阳性血清发生特异性反应。