同步抑制FAD2与FatB基因提高烟草种子油酸组分含量的研究

该研究以烟草品系NC89的无菌苗叶片为受体材料,采用前期构建的能同步抑制种子中FAD2(Δ12-油酸去饱和酶基因)与FatB(酰基转移酶基因)表达的RNAi载体,通过农杆菌介导转化获得了转基因烟草植株,分析转基因植株种子中的脂肪酸组分。结果显示:与对照相比,转基因植株种子中FAD2和FatB基因的表达水平分别降低了23%和11%;转基因植株种子的脂肪酸组分中,饱和脂肪酸棕榈酸和硬脂酸平均含量分别为8.02%和4.45%,多不饱和脂肪酸亚油酸平均含量为76.82%,较对照分别降低了2.91%、9.92%和3.47%;而转基因植株种子中单不饱和脂肪酸油酸含量高达7.48%,比对照提高46.38%。研究表明,同步抑制FAD2和FatB基因的表达能够显著提高烟草种子中油酸组分的含量,为进一步改良油料作物品质奠定了基础。

同步抑制棉籽FAD21-与FatB基因表达的RNAi载体构建

采用PCR技术,分别扩增获得靶标基因FAD21-与FatB的功能区域片段426与501bp,通过PCR引物引入特定的酶切位点,采用DNA标准重组技术与Gateway技术相结合的方法,以表达载体pBI121及RNA干扰载体pANDA35HK为基础,利用种子特异性启动子,成功构建出棉籽特异抑制双基因表达的RNAi载体。

椰子脂肪酸积累及与FatB基因表达关系研究

为筛选控制椰子果实中低碳链脂肪酸积累的关键FatB基因,本研究以海南本地高种绿椰四个发育时期的果实为试验材料,参考国家标准GB/T2906-1982谷类、油料作物种子粗脂肪测定方法,用索氏提取法提取果肉脂肪酸,应用气质联用检测技术测定各发育时期脂肪酸含量及组分,同时应用qRT-PCR对椰子脂肪酸合成相关基因FatB1、FatB2及FatB3进行相对定量分析,明确各发育时期椰子果实脂肪酸积累与FatB基因表达量变化之间的关系。结果表明:(1)椰子油含9种脂肪酸成分,在椰子果实发育的早期(第6和第7个月),棕榈酸、硬脂酸和油酸的含量较高,月桂酸和肉豆蔻酸相对含量较低,通过实时荧光定量PCR发现,此时FatB 1基因的相对表达量较高。(2)而在椰子果实发育的后期(第8和第9个月),棕榈酸、硬脂酸和油酸的相对含量迅速降低,月桂酸和肉豆蔻酸相对含量迅速升高,FatB 2和FatB 3基因的相对表达量较高,FatB 1的表达量略有降低。该研究初步掌握了椰果各发育时期FatB基因表达量与脂肪酸成分间的变化趋势,该结果为将来筛选控制椰子果实中低碳链脂肪酸积累的关键FatB基因奠定基础,同时为椰子脂肪酸成分的分子改良提供理论依据。

油茶FatB基因全长cDNA的分离克隆及序列分析

以油茶‘湘林1号’品种的近成熟种子为材料,采用简并PCR、RACE等技术,获得了油茶FatB基因的全长cDNA克隆。RACE测序结果表明:油茶FatB基因不是一个单基因,而是一个多基因家族;用生物信息学的方法预测各RACE片段的起始密码子和终止密码子的位置,在起始密码子上游和终止密码子下游分别设计RT—PCR引物,RT—PCR扩增结合随机测序、生物信息学分析,分离克隆出5个基因家族成员,分别命名为co—fatb1、co—fatb2、co—fatb3、co—fatb4、co—fatb5,其全长CDS为1 272、1 311、1 305、1 305、1 263 bp,将上述基因序列提交至GenBank,登录号分别为FJ899670、FJ899671、FJ899672、FJ899673、FJ899674;最后,对油茶FatB的氨基酸序列的特殊位点进行了标识和分析。

拟南芥FATB蛋白的亚细胞定位

为研究拟南芥中脂酰基-ACP硫酯酶B(FATB)的亚细胞定位,采用RT-PCR方法克隆FATB基因的全长cDNA,构建其与eGFP基因融合的表达载体pUC-FATB-eGFP-NOS,分离拟南芥叶肉细胞原生质体,然后将pUC-FATB-eGFP-NOS转入拟南芥叶肉细胞原生质体中表达,最后在荧光显微镜下检测到eGFP荧光信号定位于叶绿体上。

花粉管通道和农杆菌介导的花生AhFatB基因编辑

为探究CRISPR/Cas9基因编辑技术在花生中的应用,利用花粉管注射浸花法和农杆菌介导法转化花生,通过在侵染液中添加合适浓度的AS、MES以及MgCl2·6H2O促进了转化事件的发生,并通过注射液每日现用现配最大程度地保持农杆菌的活力,提高了转化效率。本试验首次将该转化法用于基于CRISPR/Cas9技术的花生基因编辑,根据花生FatB基因序列设计编辑靶位点,成功构建CRISPR/Cas9基因编辑载体PX458-Cas9-FatB并成功转化农杆菌菌株GV3101;利用1 mL无菌注射器将当日离心配置的新鲜农杆菌侵染液注射到花生龙骨瓣中至花瓣浸透,每日8:00以前完成注射,连续注射15日,待注射花朵下针后用尼龙绳进行捆绑标记;待荚果成熟后,收获捆绑标记的花生荚果,正常晾晒干燥后剥取花生籽粒,提取籽粒基因组DNA,进行PCR扩增,筛选转化阳性籽粒。结果显示,在被检测的274粒籽粒中,有108粒扩增出了相应目的条带,转基因阳性率为39.42%;经测序验证,108粒阳性籽粒中有1粒在靶位点外发生了基因编辑,在部分阳性籽粒的自交后代中,发现了靶位点发生编辑的籽粒。因此,本研究初步证实利用注射浸花以及农杆菌介导法对基于CRISPR/Cas9技术的花生基因编辑是有效的,但编辑效率有待于进一步提高。

金银花类药用植物FatB基因克隆和生物信息学分析

从忍冬(Lonicera japonica Thunb.)转录组测序结果中分析获得1个FatB基因。分别以忍冬、红白忍冬(Lonicera japonica Thunb.var.chinensis(Wats.)Bak.)、红腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq.)和水忍冬(Lonicera dasystyla Rehd.)新鲜花蕾为材料,利用RT-PCR技术克隆获得了LJFatB、LHFatB、LJCFatB、LDFatB基因的全长cDNA,并进行生物信息学分析。结果表明LJFatB、LJCFatB、LHFatB和LDFatB与拟南芥AtFatB具有较近的亲缘关系。LJFatB、LJCFatB、LHFatB和LDFatB的核苷酸序列、蛋白特性及其二级结构有所差异,但其蛋白均具有保守的FatB底物结合位点和催化活性位点,且在花蕾中的转录水平没有显著差异。因此推测LJFatB、LJCFatB、LHFatB和LDFatB可能具有与AtFatB相同的生物学功能。

油桐VfFATB1基因的克隆及其功能的初步分析

以油桐转录组数据中FATB1基因的cDNA片段为模板,通过RACE技术克隆获得该基因的CDS,命名为Vf FATB1,并进行了生物信息学分析,同时通过Real-time PCR和亚细胞定位对该基因的表达模式和表达部位进行了研究分析。结果表明Vf FATB1是一个由8个α-螺旋和10个β-折叠组成"hot-dog"折叠结构的二聚体,与JcFATB1相似度高达92%;该基因有FAT重要催化作用的半胱氨酸活性位点Cys320和3个保守的组氨酸位点His140/285/345;该基因在油脂合成后期种仁中的表达量最高,是幼根的30倍左右,且在油脂合成过程中一直是上调状态;该基因定位于叶绿体中。综上所述,Vf FATB1是一个位于叶绿体中且含有多个催化功能结构的蛋白,表达模式与油脂积累相同,因此它可能与油脂合成有着密切的关系,这为油桐的遗传改良提供了潜在的基因资源。

拟南芥xtc1突变体的图位克隆分析

【目的】分析拟南芥xtc1突变体茎部表皮蜡的组分和含量,并鉴定导致xtc1突变体表型的基因。【方法】通过气相色谱法分析拟南芥xtc1突变体与Ler野生型茎部表皮蜡的成分;利用图位克隆确定突变基因位点,通过在拟南芥xtc1突变体中过量表达FATB基因,验证突变位点与FATB基因的关系。【结果】拟南芥xtc1突变体茎部表皮蜡总量约为Ler野生型的1/3,且各组分含量均明显减少;将突变基因定位在第1染色体顶端物理距离为80kb的2个标记T27G7-3和F22O13-1之间,该区域含有21个基因。T-DNA插入突变体观察及测序分析表明,xtc1突变体在At1g08510(FATB)基因的第1个外显子上产生14个碱基的缺失,导致翻译提前终止;在xtc1突变体中过量表达FATB基因可恢复xtc1突变体的正常表型。【结论】拟南芥xtc1突变体茎部表皮蜡含量减少,且突变基因为FATB基因。