椰子Acyl-ACP硫酯酶相关基因的克隆及其表达分析

椰子是一种重要的热带油料作物,椰子果成熟后,椰子果肉脂肪酸的主要成分为C12的月桂酸。应用椰子转录组测序的结果,从中挖掘了11个脂酰-ACP硫脂酶基因,分别是2个FatA基因、4个FatB1基因、3个FatB2以及2个FatB3基因。应用荧光定量PCR检测了Unigene9211、Unigene19303、Unigene45926、Unigene27250以及Unigene22278在果肉形成的3个阶段的表达变化,结果显示,这些基因在果肉形成的3个阶段持续表达。同时,对3个时期的果肉的脂肪酸成分也进行了测定,结果显示,在椰果发育7个月时,中低碳链的脂肪酸含量较低,但随着椰果的发育,中低碳链的脂肪酸逐步增加。

甘蓝型油菜中5个脂酰-ACP硫酯酶基因的克隆与功能初步分析

为了解影响油菜种子含油量的关键基因,从高含油量(HO)和低含油量(LO)甘蓝型油菜中克隆了5个脂酰-ACP硫酯酶(fatty acyl-ACP thioesterase, FAT)的基因。序列分析表明这5个FAT基因在HO和LO油菜基因组之间没有序列差异。5个FAT基因分别命名为:BnaA.FATA.a、BnaC.FATA.b、BnaA.FATA.c、BnaC.FATB.a和BnaA.FATB.b。分析表明,HO种子中5个FAT基因的表达水平显著高于LO种子。异源表达结果显示,5个FAT基因的所有酵母转化子的含油量均显著增加,并且它们的脂肪酸组成均发生了变化。将这5个FAT基因转化到拟南芥中进行进一步的功能分析。5个转基因材料T1种子含油量均显著增加;BnaA.FATA.a、BnaC.FATA.b、BnaA.FATA.c转基因株系中的饱和脂肪酸含量显著降低,而不饱和脂肪酸含量均显著增加;相反,在BnaC.FATB.a和BnaA.FATB.b转基因材料中,饱和脂肪酸含量显著增加,而不饱和脂肪酸含量显著降低。结果表明,这5个FAT基因不仅可以增加拟南芥含油量,而且可以改变脂肪酸组成比例。

可可FAT基因家族进化及表达模式分析

在植物中,酰基-ACP硫酯酶(fatty acyl-ACP thioesterase, FAT)是调控脂肪酸合成的关键酶。为解析可可FAT基因家族成员的特点与功能,本研究从可可基因组中筛选鉴定出FAT基因家族的6个成员,分别命名为TcFATA、TcFATB1、TcFATB2、TcFATB3、TcFATB4、TcFATB5。6个基因外显子数目为6~7个,编码区(CDS)长度介于1128~1263 bp,预测蛋白分子量介于42.72~46.47 kDa,等电点介于6.57~9.10。进化分析结果表明可可FAT基因家族分成FATA与FATB亚群,FATA亚群包含1个可可TcFATA成员,FATB亚群包含5个可可TcFATBs成员。不同可可种子发育时期表达分析结果表明:TcFATA和TcFATB1伴随果实发育成熟,表达量呈下降趋势,TcFATA和TcFATB1在不同种质中表达量与油酸(C18:1)和棕榈酸(C16:0)比例呈正相关,表明其与脂肪酸组分比例调控有紧密关联。

花生酰基载体蛋白硫酯酶(FATB2)基因的克隆与表达分析

本研究从花生中分离得到1个FATB基因,命名为AhFATB2,其全长为1245bp,编码414个氨基酸,属于亲水性蛋白。利用荧光定量PCR分析了该基因在不同组织、种子不同发育时期、多种非生物逆境胁迫和激素处理下的表达情况。结果显示,AhFATB2基因在花中表达量最高,并且在种子发育过程中表达量逐渐升高。在非生物胁迫和激素处理下,AhFATB2基因的表达量均有不同程度的上调,推测该基因可能参与花生对逆境胁迫的适应性调控。该研究为将来改良花生品种提供了基因资源,同时揭示了AhFATB2基因在花生抗逆性中可能发挥的作用。

花生FAT基因家族的全基因组分析

酰基-ACP硫酯酶(fatty acyl-ACP thioesterase,FAT)是控制植物种子油脂合成的关键酶,根据其氨基酸序列和底物特异性不同可分为FATA和FATB两类。为了更深入了解花生FAT(Ah FAT)的特点与功能,本研究对Ah FAT家族基因进行了全基因组生物信息学分析。在花生基因组中共有20个FAT基因,不均匀分布在2个基因组的12条染色体上。20个Ah FATs可以分为Ah FATA和Ah FATB两个亚家族,Ah FATA亚家族有2个基因,Ah FATB亚家族有18个基因。Ah FATA家族基因具有6或8个外显子,Ah FATB家族基因结构较为复杂,外显子数目5~8个;Ah FATs都不具有跨膜结构域但是都具有保守的Acyl-ACP_TE结构域。对Ah FAT家族基因进行可变剪接分析,发现只有少数发生了可变剪接,且具有组织特异性。对Ah FATs表达模式分析的结果显示,Ah FATAs和Ah FATBs都在种子发育后期表达量较高。

油棕乙酰基酰基载体蛋白硫酯酶EgFATA基因的克隆与功能分析

为了探索油棕(Elaeis guineensis Jacq.)EgFATA基因的生物学功能,解析EgFATA基因在油棕中与脂肪酸积累的对应关系,为进一步研究EgFATA作用机制奠定基础,从油棕果cDNA中克隆得到了EgFATA基因的全长序列,经生物信息学分析发现,EgFATA编码区由1155个碱基组成,可编码385个氨基酸,相对分子量为91.89 kDa,与海藻PdFATA亲缘关系最近。在此基础上,构建EgFATA的病毒沉默载体并侵染油棕胚状体,RT-qPCR结果表明,EgFATA的表达量被下调85%~90%。同时,对基因沉默胚状体进行脂肪酸气相色谱法分析,硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)的含量均显著性降低。以上结果表明在油棕胚状体中,EgFATA对C18:0-ACP、C18:1-ACP、C18:2-ACP的水解具有催化作用,且对C18:1-ACP的催化活性最强。

拟南芥硫酯酶基因在毕赤酵母中的表达

硫酯酶在生物体内能催化水解脂酰酰基载体蛋白和饱和脂肪脂酰链,对中链脂肪酸(Medium chain fatty acids,MCFAs)的积累起着关键作用。为获得具有生产中链脂肪酸能力的工程菌,以拟南芥c DNA为模板,PCR扩增得到其脂酰-ACP硫酯酶基因At Fat A,经Eco RⅠ/XbaⅠ双酶切后连接至同样双酶切的质粒中,获得重组质粒p PICZαA-At Fat。将重组质粒电击转入毕赤酵母GS115中,通过Zeocin抗性筛选,挑选出阳性克隆子并摇瓶发酵诱导,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析获得明显目的蛋白条带,首次成功构建At Fat A的真菌表达系统。气质联用法检测发酵产物胞外游离脂肪酸,发现毕赤酵母At Fat A重组菌株比起始GS115菌株胞外游离MCFAs(主要是辛酸)产量增加51%,MCFAs产量占胞外总脂肪酸产量的28.7%,而野生菌中这一比例仅有18.1%,这为日后生产安全无毒害的MCFAs探索了一条新的途径。