利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立FcγR基因大片段敲除小鼠模型

目的使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除长度约为90kb的小鼠FcγR2b,FcγR3,FcγR4基因簇,为构建FcγR基因人源化小鼠奠定基础。方法使用在线预测软件在FcγR2b,FcγR3外显子区设计sgRNA,在每一位点挑选脱靶效应较低的五个候选sgRNA。通过CRISPR/Cas9活性检测试剂盒检测sgRNA在体外的活性。选取活性较高的sgRNA体外转录,与Cas9mRNA一并注射受精卵。通过PCR检测及测序,得到1只敲除片段为89711bp的基因修饰小鼠,且同时敲除FcγR2b基因5’端,FcγR3基因3’端及FcγR4基因。而且还利用软件预测了8个脱靶可能性最高的位点,并对首建鼠基因组的上述8个脱靶位点全部测序确认。结果结果显示未在预测脱靶位点附近发现小片段插入或缺失。结论建立了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除基因组超大片段的技术,该技术结合BAC转基因技术,将为建立含有复杂基因族的人源化小鼠提供新的途径。

小鼠FcγRⅡB基因重组腺病毒的构建及其对巨噬细胞分泌IL-10的影响

利用Ad-Max腺病毒载体系统包装含小鼠FcγRⅡB基因的重组腺病毒;采用改进的半数组织细胞感染量(TCID50)方法测定腺病毒滴度;以感染复数(MOI)为500的病毒量感染永生化小鼠骨髓来源的巨噬细胞(iBMDM),荧光显微镜观察细胞中GFP的表达,并用流式细胞术检测FcγRⅡB基因在细胞中的表达;ELISA检测FcγRⅡB蛋白对脂多糖(LPS)刺激后iBMDM细胞分泌IL-10的影响。结果表明:重组腺病毒质粒pHBAd-MCMV-GFP-FcγRⅡB构建成功;在HEK293细胞中成功包装和扩增了重组腺病毒和空载体腺病毒,滴度分别为1×1010和2×1010 pfu·mL-1;腺病毒感染iBMDM细胞72 h后,约60%的细胞表达GFP;流式细胞术结果显示,FcγRIIB膜蛋白在iBMDM细胞上高表达;ELISA结果显示,FcγRⅡB提高LPS刺激后iBMDM细胞上清液中IL-10含量。这一研究提示FcγRⅡB能抑制巨噬细胞炎症反应。

FcγRⅢB基因、G2m(23)因子与侵袭性牙周炎的研究

目的 探讨中性多形核白细胞 (polymorphonuclearneutrophils ,PMNs)表面FcγRⅢb受体遗传多态性及人类免疫球蛋白G重链遗传标记因子 G2m(2 3)因子与侵袭性牙周炎的关系。方法 侵袭性牙周炎患者 2 1例 ,健康对照 2 6名 ,提取静脉血基因组DNA及血清 ,分别用PCR和免疫斑点的方法测定FcγRⅢb基因型和G2m(2 3)因子。结果 侵袭性牙周炎患者FcγRⅢBNA1 /NA1基因型检出率高于健康对照 (P <0 0 5) ;侵袭性牙周炎患者中FcγRⅢb基因型为NA1 /NA1 ,并且G2m(2 3)阳性的个体比率比健康对照组高 (P <0 0 5) ;G2m(2 3)因子在侵袭性牙周炎患者与健康对照组中的分布差异无显著性。结论 FcγRⅢBNA1 /NA1基因可能是中国人侵袭性牙周炎的易感基因 ;FcγRⅢb基因型为NA1 /NA1 ,G2m(2 3)

湖南汉族系统性红斑狼疮患者FcγRⅢa—158V/F多态性研究

目的探讨中国湖南汉族SLE患者与FcγRⅢa—158V/F多态性的相关性。方法SLE患者65例,其中狼疮肾炎患者38例,采用多聚酶链反应(PCR)和限制性片段长度多态性分析法(RFLP)检测FcγRⅢa—158V/F基因型,并与60例正常人进行比较。结果①与对照组相比,SLE患者FcγRⅢa—158F/F纯合子基因型显著增高(OR=2.23,χ2=4.69,P=0.03)。②与对照组相比,狼疮肾炎患者Fc-γRⅢa—158F/F纯合子基因型和FcγRⅢa—158F等位基因频率均显著增高(OR=2.67,χ2=5.36,P=0.02;OR=2.00,χ2=4.91,P=0.03)。结论SLE患者FcγRⅢa—158F/F纯合子基因型显著增高,狼疮肾炎患者FcγRⅢa—158F/F纯合子基因型和FcγRⅢa—158F等位基因频率均显著增高,提示FcγRⅢa多态性与SLE相关,FcγRⅢa—158F等位基因可能是狼疮肾炎的危险因素。