等瓣置换反应研究──异核四面体簇合物（μ_3－S）FeMoCo（η~5－RC_5H_4）（CO）_8和（μ_3－S）FeMoNi（η~5－RC_5H_4）（η~5－C_5H_5）（CO）_5（R＝CH_3CO，H）的合成及结构

通过η~５－ＣＨ_３ＣＯＣ_５Ｈ_４（ＣＯ）_３ＭｏＮａ与（μ_３－Ｓ）ＦｅＣｏ_２（ＣＯ）_９的反应合成了（μ_３－Ｓ）－ＦｅＭｏＣｏ（η~５－ＣＨ_３ＣＯＣ_５Ｈ_４）（ＣＯ）_８１，１进一步与（η~５－Ｃ_５Ｈ_５）_２Ｎｉ的反应合成了（μ_３－Ｓ）－ＦｅＭＯＮｉ（η~５－ＣＨ_３ＣＯＣ_５Ｈ_４）（η~５－Ｃ_５Ｈ_５）（ＣＯ）_５２，（μ_３－Ｓ）ＦｅＭｏＮｉ（η~５－Ｃ_５Ｈ_５）（η~５－Ｃ_５Ｈ_５）－（ＣＯ）_５３及（μ_３－Ｓ）ＦｅＭｏＣｏ（η~５－Ｃ_５Ｈ_５）（ＣＯ）_８４。除用元素分析，ＩＲ，~１ＨＮＭＲ，ＭＳ表征它们的结构外，尚用Ｘ－射线衍射法测得２的单晶分子结构。２属单斜晶系，空间群Ｐ２_１／ｎ（ＮＯ．１４），ａ＝１４．９５８（２），ｂ＝８．５０５（１），ｃ＝１５．６０８（１）Ａ，β＝１０３．６５（３）°，Ｚ＝４，Ｖ＝１９２９．５（１０）Ａ~３，Ｄ_ｃ＝１．９１０ｇ／ｃｍ~３，Ｆ（０００）＝１０９６，μ＝２．４８６ｍｍ^（－１），Ｒ＝０．０５１，Ｒ_ω＝０．０６６。２的簇核是一个扭曲的四面体，分子中有两种羰基：末端羰基和半桥羰基。

钼铁蛋白铁钼辅因子的有机组分对其功能的影响

棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶的钼铁蛋白经邻菲啰啉在厌氧或有氧环境中处理后,变为 P-cluster 单一缺失或 P-cluster 和 FeMoco 同时缺失的失活钼铁蛋白。含柠檬酸盐或高柠檬酸盐的重组液都使这两种失活蛋白能恢复固氮酶重组的 H^+和 C_2H_2还原活性,活性恢复程度随反映钼铁蛋白中金属原子簇含量变化的圆二色和磁圆二色谱及金属含量的恢复程度的提高而提高,但它们固 N_2能力的恢复程度则不相同:P-cluster 单一缺失的蛋白用两种重组液重组后均可恢复其固 N_2能力,而 P-cluster 和 FeMoco 同时缺失的蛋白,只有用含高柠檬酸盐的重组液重组才恢复其固 N_2能力,表明含不同有机组分的重组液所组装的 P-cluster 均与天然状态相同,只有含高柠檬酸盐的重组液所组装的 FeMoco 才与天然状态相同,从而证明高柠檬酸盐是 FeMoco 的必需的有机组分。

缺失nifH的棕色固氮菌突变种固氮酶钼铁蛋白的结晶

从限氨固氮培养基中培养的缺失nifH的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种DJ54中，分离纯化出部分纯的缺失FeMoco的钼铁蛋白(△nifH Avl)。用相同纯化方法分别从DJ35和UW45突变种中纯化的△nifE Avl和NifB^-Avl的纯度明显高于△nifH Avl的纯度。在合适的结晶条件下，可得到这三种蛋白的深棕色短斜四棱柱晶体。△nifH Avl与NifB^-Avl一样，晶体形成所需的时间比△nifE Avl的长。而它结晶所需的沉淀剂和缓冲液最适浓度则与△nifE Avl的相同。SDS—PAGE鉴定表明，结晶的△nifH Avl与OP Avl的组成相似。这表明，在△nifH Avl溶液中形成的晶体可能就是该蛋白质的晶体。

对与缺失铁钼辅基的固氮酶钼铁蛋白重组的原子簇的结构要求(英文)

棕色固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）钼铁蛋白与邻菲口罗啉和Ｏ２ 保温并经凝胶柱层析后，成为部分缺失Ｐ－ｃｌｕｓｔｅｒ和ＦｅＭｏｃｏ 的失活蛋白。由３ 个－ ＯＣＨ３－ 连结于Ｍｏ原子间的２ 个１Ｍｏ∶３Ｆｅ∶４Ｓ结构单位组成的原子簇与４Ｆｅ∶４Ｓ原子簇的混合液，以及由ＫＭｎＯ４、高柠檬酸铁、Ｎａ２Ｓ和二硫苏糖醇组成的重组液均可使这种失活蛋白明显恢复Ｃ２Ｈ２ 还原活性，但都不能使可被ＦｅＭｏｃｏ 激活的ｎｉｆＥ和ｎｉｆＨ 基因缺失突变种及ＵＷ ４５的Ａｐｏ－ＭｏＦｅ 蛋白得到激活。表明，不能合成ＦｅＭｏｃｏ 的固氮菌突变种蛋白只能与具有ＦｅＭｏｃｏ相似或基本相似结构的原子簇进行体外重组，而部分缺失金属原子簇的钼铁蛋白能与具有一定结构和组成的原子簇进行体外重组，变为具有催化氮还原能力的各种固氮酶组分蛋白。

高柠檬酸盐对固氮酶铁钼辅基重组活性的影响

用高柠檬酸铁、柠檬酸钠、ＡＴＰ和Ｎａ２ＭｏＯ４分别处理ＦｅＭｏｃｏ，然后与ＵＷ４５组份Ⅰ蛋白进行重组，结果发现，高柠檬铁和柠檬酸钠分别使ＦｅＭｏｃｏ重组体的Ｃ２Ｈ２还原活性提高６７％和５４％，Ｎ２还原活性分别提高１７０％和１３５％．ＦｅＭｏｃｏ与ＡＴＰ预作用后再分别与高柠檬酸铁、柠檬酸钠作用，其重组体的Ｃ２Ｈ２还原活性分别提高１２１％和１１９％，而Ｎ２还原活性分别提高３０３％和１３５％．而ＦｅＭｏｃｏ，ＦｅＭｏｃｏ－高柠檬酸铁体系及ＦｅＭｏｃｏ－ＡＴＰ－高柠檬酸铁体系与Ｎａ２ＭｏＯ４作用后，重组体的Ｃ２Ｈ２还原活性分别下降５％，１２％及２１％．ＦｅＭｏｃｏ－高柠檬酸铁体系在１４．６Ｋ下的ＥＰＲ谱，与单独ＦｅＭｏｃｏ的略有不同，而ＦｅＭｏｃｏ－ＡＴＰ－高柠檬酸铁体系的ＥＰＲ谱则与前者有明显的差异．研究结果表明，高柠檬酸可能是ＦｅＭｏｃｏ的有机组份，它可能结合在ＦｅＭｏｃｏ的Ｍｏ原子上，而这种结合是比较松散的．

缺失nifE的棕色固氮菌突变种MoFe蛋白的纯化及体外激活(英文)

经DEAE纤维素、Sephacryl S-300和Q-Sepharose柱层析分离纯化,从缺失nifE的棕色固氮菌(Azotobactervinelandii Lipmann)突变种(DJ35)的无细胞粗提物中得到ΔnifE MoFe蛋白(ΔnifE Av1)。SDS凝胶电泳分析表明,ΔnifE Av1的亚单位种类和分子量分别与棕色固氮菌野生型(OP)MoFe蛋白(Av1)的α和β亚单位相似。当与固氮酶Fe蛋白(Av2)活性互补时,ΔnifE Av1不具有还原质子的能力,但从OP Av1中抽提的FeMoco却可使其激活。经过量的邻菲啰啉(o-phen)厌氧处理并经Sephadex G-25柱层析分离后,便得到ΔnifE Av1(C)。在同时存在Av2和MgATP发生系统的条件下,ΔnifE Av1(C),而不是ΔnifE Av1,可为由KMnO_4、高柠檬酸铁、Na_2S、Na_2S_2O_4和二硫苏糖醇组成的含Mn重组液(RS-Mn)显著激活。但在缺少MgATP或Av2的条件下,RS-Mn则不能激活ΔnifE Av1(C)。这就表明,RS-Mn对ΔnifE Av1(C)的激活需要o-phen的预先处理及同时存在Av2和MgATP的这二个条件。

Characterization of a FeMo cofactor-deficient MoFe protein from a nifE-deleted strain(DJ35)of Azotobacter vinelandii

A MoFe protein (ΔnifE Av1) with a purity of ～80% was purified from a nifE-deleted mutant of Azotobacter vinelandii DJ35. Compared with MoFe protein purified from wild-type strain OP (OP Av1), ΔnifE Av1 had the same subunits composition, and had immune reaction with antibody to OP Av1, but its relative mobility in anaerobic native polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) was a little larger than that of OP Av1. Metal analysis showed that Mo and Fe contents of ΔnifE Av1 both apparently decreased. When complemented with OP Fe protein, ΔnifE Av1 had no C2H2-reduction activity, but it could be in vitro activated by FeMoco extracted from OP Av1. The circular dichroism (CD) spectrum of ΔnifE Av1 at ~450 nm was similar to that of OP Av1, while the EPR signal at g≈3.7 was absolutely silent, and the signal intensities at g≈4.3 and 2.0 decreased by 75% and 50%, respectively. The results indicated that ΔnifE Av1 purified from DJ35 was a FeMoco-deficient but P-cluster-con- taining MoFe protein.