福州野生蕉FeSOD家族基因的克隆及在低温胁迫下的表达分析

以抗寒性较强的福州野生蕉为材料,采用RACE和RT-PCR扩增得到铁超氧化物歧化酶(FeSOD)家族基因(FeSOD)的2个成员共4条转录本,分别命名为MuFSD1A(登录号JX844026)、MuFSD1B(登录号KJ786318)、MuFSD1B-variant1(登录号KJ786319)和MuFSD1B-variant2(登录号KJ786320)。MuFSD1A基因cDNA全长为1 277bp,编码300个氨基酸;MuFSD1B基因cDNA全长为1 378bp,编码260个氨基酸。基因结构分析表明MuFSD1B-variant1和MuFSD1B-variant2为MuFSD1B的可变剪接转录本。生物信息学和亚细胞定位分析显示,MuFSD1A和MuFSD1B主要定位于叶绿体,但他们的理化性质、磷酸化位点、蛋白结构等存在差异。序列比对分析发现MuFSD1A和MuFSD1B相似性仅为33.33%,但都具有保守的金属结合位点和FeSOD的特征氨基酸。进化树分析显示,MuFSD1A和MuFSD1B聚在不同的分支中。qRT-PCR分析表明,低温诱导MuFSD1A基因的表达而抑制MuFSD1B基因的表达,且MuFSD1A基因的相对表达量随着温度的降低而显著增加,说明该成员可能在香蕉抗寒中起主要作用。

甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因的克隆及菌核病菌诱导表达

依据拟南芥、芥菜型油菜和白菜已知超氧化物歧化酶(SOD)保守序列设计引物,用同源序列法和RT-RACE技术克隆甘蓝型油菜Cu/ZnSOD和FeSOD基因,经序列分析和基因片段拼接,得到Cu/ZnSOD和FeSOD基因的全长cDNA,分别为756 bp(GenBank登录号AY970822)和1 037 bp(GenBank登录号EF634058)。以cDNA序列设计引物,获得1 322 bp的Cu/ZnSOD基因组DNA(GenBank登录号DQ431853)和1 659 bp的FeSOD基因组DNA(GenBank登录号EF634057)。生物信息学分析表明,Cu/ZnSOD基因ORF框长459 bp,编码152个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有7个外显子和6个内含子。而FeSOD基因ORF框长792 bp,编码263个氨基酸残基的蛋白质,在基因组序列结构上具有8个外显子和7个内含子。二者外显子和内含子交接处完全符合GT/AG规则。利用获得的Cu/ZnSOD的cDNA片段作探针,对菌核病菌诱导甘蓝型油菜叶片的mRNA进行Northern blot分析,结果显示在同一品种(系)中菌核病菌诱导后Cu/ZnSOD mRNA表达量比诱导前升高,抗(耐)型油菜Cu/ZnSOD mRNA表达量明显高于感病型。油菜叶片SOD酶活性分析结果也获得了完全一致的结果。以上结果表明,甘蓝型油菜SOD基因与菌核病抗性相关。

刚毛柽柳FeSOD基因的克隆及耐盐应答分析

植物响应盐胁迫逆境,涉及一系列的保护酶类基因的表达和调控,SOD酶是其中重要的一类。本研究通过对盐胁迫后7个柽柳转录组分析和进一步测序验证,获得了2个柽柳FeSOD基因全长cDNA序列,它们编码蛋白的氨基酸残基数分别为256、308,分子量为63.8、75.4 kDa,理论等电点为5.0和5.1。实时荧光定量PCR结果显示这2个FeSOD基因在盐胁迫后柽柳根和叶中呈现不同的表达模式。在根中,第9天时,ThFeSOD1和ThFeSOD2基因的表达均明显上调。在叶中,ThFeSOD1和ThFeSOD2在胁迫3天受明显的诱导,而5天表达受明显的抑制。

小麦Fe超氧歧化酶基因的原核表达分析

采用RT-PCR技术分离小麦Fe超氧歧化酶基因(FeSOD)的ORF全长cDNA,然后构建其原核表达载体,并对其表达的诱导时间、IPTG浓度、温度进行优化,以期获得较大量的重组蛋白。结果表明:实验获得了小麦FeSOD基因的ORF全长(600bp),ORF全长与原核表达载体pET-Dute1相连接构建了原核表达载体pET-FeSOD,将pET-FeSOD导入宿主菌Rosetta(DE3)中,经SDS-PAGE电泳结果显示,可以高效表达融合蛋白且表达的蛋白均主要以包涵体的形式存在;重组质粒表达出25.8kD的融合蛋白,除去载体pET-Duet1自身表达的3.0kD蛋白后,与FeSOD编码的约为22.8kD蛋白的大小一致;对诱导表达条件的优化结果显示,融合蛋白pET-FeSOD最佳的诱导表达条件为:0.5mmol/L的IPTG浓度,37℃诱导5h。该研究结果为进一步深入研究该基因的特性与功能奠定了基础。

雨生红球藻铁型超氧化物酶基因的克隆与序列分析

利用已报道的FeSOD保守区域,设计简并引物,通过简并PCR的方法获得了雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)FeSOD(HpFeSOD)cDNA的部分序列,然后采用RACE方法分别克隆到5′端和3′端。拼接后得到HpFeSOD cDNA全长,该基因全长为1 138 bp,ORF为684 bp,编码227个氨基酸。把已经得到的HpFeSOD序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的FeSOD氨基酸序列相比较,雨生红球藻FeSOD与杜氏藻、衣藻、团藻、石莼、颤藻的同源性为89%、83%、78%、70%和63%。分子系统学分析表明,雨生红球藻FeSOD与杜氏藻FeSOD聚在一起,介于真菌与高等植物之间并且真核微藻FeSOD与高等植物的同源性更高,推测其在进化上与高等植物的亲源关系更近。