大肠杆菌F18ac菌毛FedA蛋白的表达与鉴定

根据已经发表的F18ac菌毛A亚单位的基因序列(FedA)设计一对引物,利用PCR技术从重组质粒T 8813A 中扩增到一段序列,并按预定的阅读框插入表达性质粒载体pGEX 6p 1中的谷胱苷肽转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pPFedA/ac,并转化大肠杆菌BL 21 获得重组菌PPFedA/ac。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明,该序列大小为456 bp,与已发表的FedA/ac结构编码序列完全一致。通过对菌体裂解物的SDS PAGE 分析以及Western blotting 鉴定,证明重组大肠杆菌PP FedA/ac的可以表达融合蛋白形式的FedA/ac (命名为GST FedA/ac),即FedA/ac蛋白(15.317 ku)与谷胱苷肽转移酶(27.335 ku)相连组成分子量为42.652 ku的融合蛋白。利用GST FedA/ac制备的兔抗GST FedA/ac 血清与大肠杆菌F107/86 株( F18ab+ )、2 134 P 株(F18ac+)进行的玻板凝集试验呈现阳性反应,进一步表明了表达的正确性。

F18ac菌毛A亚单位基因的克隆与序列分析

根据已经发表的F18ab菌毛A亚单位 (FedA/ab)的基因 (fedA/ab) [1] ,设计一对引物 ,利用PCR技术从表达F18ac菌毛的大肠杆菌 2 134P株[2 ] 、8199株[3 ] 、8813株[3 ] 中分别扩增到一段序列 ,并克隆至 pGEM_T载体 ,获得重组质粒T2 134PA、T8199A、T8813A。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明 ,该 3个序列大小均为 5 16bp ,与fedA/ab(5 13bp)具有较高的同源性 ,分别为 96 3%、96 5 %、95 9% ,推导的Fed/ac氨基酸序列与FedA/ab同源性分别为 93 0 %、93 6 %、92 4 %。数据表明该实验所克隆的序列均为F18ac菌毛A亚单位 (FedA/ac)的基因 (fedA/ac)。