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猫1型疱疹病毒分离鉴定及部分生物学特性分析
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作者 郑焕琴 姜晓敏 +5 位作者 岳红 王宝岩 刘洋 张兴晓 张建龙 朱洪伟 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期3040-3048,共9页
本试验旨在从临床样品中得到猫1型疱疹病毒(feline herpesvirus-1,FHV-1)分离株,为FHV-1疫苗候选毒株的研究奠定基础。从宠物医院采集疑似感染FHV-1的猫的眼鼻拭子,用猫肾细胞(Crandell reese feline kidney,CRFK)进行病毒分离,并进行... 本试验旨在从临床样品中得到猫1型疱疹病毒(feline herpesvirus-1,FHV-1)分离株,为FHV-1疫苗候选毒株的研究奠定基础。从宠物医院采集疑似感染FHV-1的猫的眼鼻拭子,用猫肾细胞(Crandell reese feline kidney,CRFK)进行病毒分离,并进行分离株的遗传进化分析、形态学电镜观察以及动物回归试验等系统评价。结果显示:用CRFK细胞对临床样品进行分离培养,经PCR和间接免疫荧光方法鉴定为FHV-1,并命名为“FHV-ZH2202”株。经高通量测序以及基因参考组装拼接获得病毒的全基因组序列后,将其与国内流行毒株进行SNP分析,发现非同义突变SNP主要集中分布在UL22和US7基因。通过构建系统发育树对FHV-ZH2202与国内外流行株进行分析,FHV-ZH2202株与国内外流行株在UL22基因的同源性较高,但对于US7基因具有相对较远的亲缘性。动物回归试验结果表明,FHV-ZH2202株感染组猫全部发病,出现打喷嚏、眼鼻分泌物等典型症状,但无死亡病例出现。感染后第2天开始,感染组猫通过眼鼻向外界排毒,持续6~8 d。本研究成功分离到1株FHV-1病毒,并对其部分生物学特性进行了鉴定,证明FHV-ZH2202株具有一定的致病性,为FHV-1疫苗候选毒株的研究提供一定的参考。 展开更多
关键词 1型疱疹病毒 分离鉴定 生物学特性分析 高通量测序 动物回归试验
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邯郸市猫疱疹病毒HD1株的分离与鉴定
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作者 余紫葳 蒋艳妹 +3 位作者 宋金祥 崔德福 刘永相 范春艳 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第7期58-64,共7页
为了探究猫疱疹病毒(FHV)在邯郸地区的分子流行病学特征,从邯郸地区不同动物医院收集到有呼吸道症状猫的眼、鼻分泌物共55份,经PCR初检后,将阳性样本接种于猫肾细胞(CRFK),细胞产生病变,经过蚀斑纯化、分子生物学检测、血清学鉴定、病... 为了探究猫疱疹病毒(FHV)在邯郸地区的分子流行病学特征,从邯郸地区不同动物医院收集到有呼吸道症状猫的眼、鼻分泌物共55份,经PCR初检后,将阳性样本接种于猫肾细胞(CRFK),细胞产生病变,经过蚀斑纯化、分子生物学检测、血清学鉴定、病毒形态鉴定,得到1株FHV。用gD基因引物扩增FHV分离株基因后能够得到特异性条带,且经过3轮蚀斑纯化后,得到1株亚克隆毒株,命名为FHV HD1。FHV HD1 P3代在CRFK上的病毒滴度为10^(6) TCID_(50)/100μL,并检测生长过程中8个时间点的病毒滴度,绘制分离株生长曲线。使用FHV-1特异性抗体进行间接免疫荧光检测,结果FHV HD1能够出现特异性荧光。BLAST分析表明FHV HD1株gD基因与其他FHV-1相似性达98.25%~99.91%。进化树分析表明与猫科动物源FHV-1亲缘关系较近,处于同一大分支,与犬疱疹病毒和其他动物疱疹病毒亲缘关系较远。本研究结果为FHV的进化分析和现阶段疫苗研发奠定了基础,对猫病毒性鼻气管炎的病原学、免疫学、临床诊断及分子生物学的研究具有重要参考价值。 展开更多
关键词 猫疱疹病毒1 分离鉴定 生长动力学 GD基因
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猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型三重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量:1
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作者 陈林文 冀伟 +5 位作者 曹龙龙 王莹 李秋燕 曹胜波 陈清秀 周登元 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期1141-1147,1198,共8页
为建立一种能够快速检测猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒1型(FHV-1)的三重荧光定量RT-PCR方法,本研究根据FPV VP2基因、FCV ORF2基因和FHV-1 TK基因分别设计引物与探针,采用上述引物经PCR分别扩增上述3种病原... 为建立一种能够快速检测猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒1型(FHV-1)的三重荧光定量RT-PCR方法,本研究根据FPV VP2基因、FCV ORF2基因和FHV-1 TK基因分别设计引物与探针,采用上述引物经PCR分别扩增上述3种病原的目的基因并克隆至pMD18-T载体中,构建重组质粒标准品pMD18-T-FPV、pMD18-T-FCV和pMD18-T-FHV-1,并均经PCR和测序鉴定。将3种重组质粒标准品稀释到同一浓度1×10^(8)拷贝/μL,按体积比1∶1∶1混合后作为模板,采用方阵法优化各反应条件后,建立了检测上述病原的三重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。以FPV、FCV、FHV-1、猫博卡病毒、猫冠状病毒、猫支原体、猫白血病病毒、猫星状病毒的基因组为模板采用本研究建立的方法检测,评估该方法的特异性,结果显示,该方法仅能检测到FPV、FCV、FHV-1,而其他病原的检测结果均为阴性。选取1×10^(0)拷贝/μL~1×10^(6)拷贝/μL的混合质粒标准品和10^(-0.5) TCID_(50)/mL~10^(5.5) TCID_(50)/mL的混合病毒液分别作为模板,采用本研究建立的方法检测,评估该方法检测重组质粒和病毒的敏感性,结果显示,该方法对重组质粒标准品pMD18-T-FPV、pMD18-T-FCV和pMD18-T-FHV-1的检测限均为1.0×10^(1)拷贝/μL,对3种病毒的检测限均约为10^(0.5) TCID_(50)/mL;以1×10^(7)拷贝/μL、1×10^(5)拷贝/μL、1×10^(3)拷贝/μL质粒标准品混合物作为模板分别进行组内和组间的重复性试验,结果显示,组内和组间重复性试验的变异系数(CV)均低于3%。利用建立的该三重荧光定量RT-PCR和常规PCR对81份临床样品(77份猫的眼、鼻、咽、肛混合拭子样品和4份组织病料样品)分别检测,结果显示三重荧光定量RT-PCR检测出47份FPV、13份FCV和13份FHV-1阳性样品,而常规PCR分别检测出39份FPV、9份FCV和6份FHV-1阳性样品,该三重荧光定量RT-PCR与FPV、FCV、FHV-1常规PCR的总符合率分别为90.12%、95.06%、92.59%。本研究建立的三重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,为FPV、FCV、FHV-1临床样品的快速鉴别检测提供了有力技术支持。 展开更多
关键词 猫泛白细胞减少症病毒 猫杯状病毒 猫疱疹病毒1 三重荧光定量RT-PCR
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A Review: Interactions of Equine Herpesvirus-1 with Immune System and Equine Lymphocyte 被引量:2
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作者 Nor Dini Rusli Khairiyah Binti Mat Hasnita Che Harun 《Open Journal of Veterinary Medicine》 2014年第12期294-307,共14页
Equine herpesvirus-1 (EHV-1) remains one of the most common viral pathogens affecting horses worldwide presenting as a persistent infection which can establish latency in nerve ganglia (trigeminal ganglion), lymphoid ... Equine herpesvirus-1 (EHV-1) remains one of the most common viral pathogens affecting horses worldwide presenting as a persistent infection which can establish latency in nerve ganglia (trigeminal ganglion), lymphoid tissues of the respiratory tract and peripheral blood lymphocytes. EHV-1 infection induces both humoral and cellular immune responses in horses. Virus neutralising antibody, particularly in the nasopharynx, is to kill free virus shed from infected epithelial cells. Hence this antibody has important functions in reducing virus shedding and spreading infection to cohorts. Cellular immune responses, particularly those carried out by cytotoxic T lymphocyte (CTL), have been shown to be effective in killing virus-infected cells in vitro. This review underlines the state of knowledge regarding immunity to EHV-1 and also its interaction with equine lymphocyte. Finally, the review also includes the importance of the viral immediate early (IE) protein in the pathogenesis of EHV-1. This information can be used as the basis for future research. 展开更多
关键词 EQUINE herpesvirus-1 (EHV-1) LYMPHOCYTE CYTOTOXIC T LYMPHOCYTE (CTL) Immune Response Peripheral Blood MONONUCLEAR cell (PBMC)
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Cloning and Sequence Analysis of Glycoprotein D Gene of Bovine Herpesvirus-1 Strain Luojing
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作者 LIJi-chang TONGGuang-zhi +2 位作者 QIUHua-Ji ZHOUYan-Jun XUEQiang 《Journal of Northeast Agricultural University(English Edition)》 CAS 2003年第2期137-140,共4页
By means of PCR,the gene encoding gD of bovine herpesvirus-1 (BHV-1) strain Luojing was amplified,cloned and sequenced.The nucleotide sequence of this gD gene was (1 251 bp,)encoding 417 amino acids.Comparied with the... By means of PCR,the gene encoding gD of bovine herpesvirus-1 (BHV-1) strain Luojing was amplified,cloned and sequenced.The nucleotide sequence of this gD gene was (1 251 bp,)encoding 417 amino acids.Comparied with the published P8-2 strain,the homology of the necleotide sequence is 99.92%,and that of the deduced amino acid sequence is 100%.The results indicated that gD of BHV-1 was highly conservative. 展开更多
关键词 bovine herpesvirus-1(BHV-1) D glycoprotein gene(gD) CLONING sequence analysis.
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猫疱疹病毒Ⅰ型gIgE基因缺失毒株的构建及生物学特性分析
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作者 张晶晶 孙慧敏 +1 位作者 宋家升 鲍恩东 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期515-521,共7页
[目的]为了开发一种能够预防感染、阻止潜伏期建立的猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)弱毒疫苗,利用同源重组以及CRISPR/Cas9技术将FHV-1的gIgE基因替换为红色荧光蛋白基因(RFP)。[方法]构建针对gIgE基因的3条sgRNA及表达Cas9蛋白的质粒,将含有sg... [目的]为了开发一种能够预防感染、阻止潜伏期建立的猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)弱毒疫苗,利用同源重组以及CRISPR/Cas9技术将FHV-1的gIgE基因替换为红色荧光蛋白基因(RFP)。[方法]构建针对gIgE基因的3条sgRNA及表达Cas9蛋白的质粒,将含有sgRNA及Cas9蛋白的质粒与含有RFP的转移载体共转染到猫肾细胞(F81),通过噬斑纯化以及有限稀释方法进行病毒纯化,以重组病毒感染F81细胞连续10代验证其遗传稳定性,通过测定重组病毒以及亲本病毒H07的病毒滴度、一步生长曲线以及判断噬斑大小评价其生物学特性。[结果]成功构建了FHV-1 gIgE基因缺失毒株并将其命名为FHV-ΔgIgE-RFP;提取重组病毒DNA,通过PCR验证gIgE基因无目的条带,表明重组病毒纯化成功,再通过PCR验证RFP基因有目的条带,表明重组病毒成功插入外源基因。病毒滴度测定结果显示,与亲本病毒相比重组病毒的病毒滴度下降了90%;在F 1—F 10连续传代过程中RFP荧光表达且无减弱现象,表明重组病毒可稳定表达外源基因;测定FHV-ΔgIgE-RFP以及H07的生长曲线,重组病毒的生长趋势与亲本病毒大致相同,表明插入外源基因并不会改变病毒本身的生长特性;噬斑观察及染色结果显示,在病毒感染细胞前、后期,重组病毒的噬斑都小于亲本病毒,表明缺失gIgE基因后病毒毒力下降。[结论]成功构建并筛选出FHV-1 gIgE基因缺失致弱毒株,为开发疱疹病毒弱毒活载体疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1) 致弱毒株 重组病毒 病毒筛选
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猫疱疹病毒1型的分离鉴定及gD基因序列分析 被引量:9
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作者 孙春艳 钱鹏 +8 位作者 王洁 曹玉娇 崔宁宁 霍宁宁 黄柏成 习向锋 刘玉秀 林德贵 田克恭 《动物医学进展》 北大核心 2020年第3期30-35,共6页
为研究猫疱疹病毒1型(FHV-1)的分子流行病学特征,对2016年-2017年从洛阳及天津地区多家宠物医院收集的具有上呼吸道感染症状的病猫眼鼻拭子样品,用FK-81细胞进行病毒分离,通过间接免疫荧光试验、电镜形态观察和gD基因测序分析等方法鉴... 为研究猫疱疹病毒1型(FHV-1)的分子流行病学特征,对2016年-2017年从洛阳及天津地区多家宠物医院收集的具有上呼吸道感染症状的病猫眼鼻拭子样品,用FK-81细胞进行病毒分离,通过间接免疫荧光试验、电镜形态观察和gD基因测序分析等方法鉴定所分离的病毒,并进行病毒体外生长动力学研究。结果显示,病料在FK-81细胞上接种后24 h^36 h呈现变圆、融合、局灶性堆积聚团和脱落等细胞病变;分离毒株可被FHV-1单克隆抗体特异性识别;电镜下可观察到病毒粒子呈圆形、有囊膜、直径约130 nm,具有疱疹病毒科的典型形态特征,将所分离到的5株FHV-1分别命名为2016TJ1株、2016TJ2株、2017LY1株、2017LY2株和2017LY3株;病毒一步生长曲线测定结果显示,接种后12 h^36 h病毒快速增殖,40 h^60 h病毒滴度达到高峰,72 h病毒滴度开始下降;5株FHV-1 gD基因序列之间的同源性为100%,核酸序列高度保守且与国内外流行株及疫苗株的同源性极高。研究结果为我国宠物猫群中FHV-1的病原分离、分子流行病学调查等研究积累了资料。 展开更多
关键词 猫疱疹病毒1 gD基因序列分析 分离鉴定 生长动力学
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猫疱疹病毒1型RPA-Cas12a-LFD检测方法的建立及初步应用 被引量:4
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作者 黄坚 刘韵佳 +1 位作者 杨晓农 李妍 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1638-1643,共6页
猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus-1,FHV-1)为水痘病毒属的双链DNA包膜病毒,是引起猫上呼吸道感染的主要病原之一。本研究以重组聚合酶扩增(RPA)、Cas12a反式酶切反应和侧流层析试纸条(LFD)显示技术为基础,旨在建立靶向FHV-1 TK基因的R... 猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus-1,FHV-1)为水痘病毒属的双链DNA包膜病毒,是引起猫上呼吸道感染的主要病原之一。本研究以重组聚合酶扩增(RPA)、Cas12a反式酶切反应和侧流层析试纸条(LFD)显示技术为基础,旨在建立靶向FHV-1 TK基因的RPA-Cas12a-LFD快速可视化检测方法。根据FHV-1 TK基因的保守片段序列设计RPA引物和合成crRNA的引物,并通过反应体系验证、RPA-Cas12a-LFD检测灵敏度和特异性分析,以及临床样本的符合检测,评价FHV-1 RPA-Cas12a-LFD方法的有效性。结果显示,建立的FHV-1 RPA-Cas12a-LFD方法可以特异性地检出FHV-1(与其他猫相关病原无交叉反应),灵敏度极高(最低检测限为2.35×10^(-1) copies·μL^(-1)),检测时间短,结果可视化。该方法对20份表现明显症状的患猫呼吸道样本的FHV-1检出率(35%,7/20)高于现有的TB Green qPCR方法(25%,5/20),对其中5份阳性样本的检测符合率为100%。综上表明,成功建立的FHV-1 RPA-Cas12a-LFD检测方法的特异性好和敏感性极高,不需要特殊的检测设备,可以作为FHV-1现场快速检测的有效工具。 展开更多
关键词 猫疱疹病毒1 RPA-Cas12a-LFD 核酸检测 应用
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FHV-1阳性猫角膜腐骨病不同手术方式治疗效果的比较 被引量:1
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作者 毕静文 达举云 +1 位作者 史金莲 张勇 《动物医学进展》 北大核心 2022年第10期126-131,共6页
为探究猫角膜腐骨病最佳治疗方式,试验选取了患猫角膜腐骨病的病例共90例,应用PCR方法对患猫眼、鼻、口拭子样本进行猫疱疹病毒1型(FHV-1)检测。对检出的26例FHV-1阳性患猫采取了不同的手术方式进行治疗。术后1个月通过裸眼观察对比角... 为探究猫角膜腐骨病最佳治疗方式,试验选取了患猫角膜腐骨病的病例共90例,应用PCR方法对患猫眼、鼻、口拭子样本进行猫疱疹病毒1型(FHV-1)检测。对检出的26例FHV-1阳性患猫采取了不同的手术方式进行治疗。术后1个月通过裸眼观察对比角膜透明度,发现采用生物补片修补术的优于自体角膜结膜板层移植术的,采用自体角膜结膜板层移植术的优于结膜瓣遮盖术的。为了探究治疗效果更好的手术方式,进行了异种角膜移植治疗猫角膜腐骨的尝试。对1例角膜腐骨患猫进行了兔角膜板层移植,1周后拆除第三眼睑遮盖,发现眼部毛细血管网沿角膜缘向角膜爬行速度较正常时间快1倍,3周后角膜基本透明仅有少量瘢痕。结果表明生物补片修补术治疗效果好于其他方法,兔角膜板层植片方式可尝试但还需要进一步验证。 展开更多
关键词 角膜腐骨 猫疱疹病毒1 手术治疗 异种角膜板层移植术
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猫疱疹病毒Ⅰ型、猫杯状病毒、支气管败血波氏杆菌多重荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量:4
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作者 周红蕾 程淑琴 +3 位作者 李佳鹏 刘涵 姚志兰 张蕾 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第3期130-138,共9页
旨在建立检测猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus 1,FHV-1)、猫杯状病毒(Feline calicivirus, FCV)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)多重TaqMan荧光定量PCR方法。基于FHV-1的胸苷激酶(TK)基因、FCV的衣壳蛋白VP1基因... 旨在建立检测猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus 1,FHV-1)、猫杯状病毒(Feline calicivirus, FCV)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)多重TaqMan荧光定量PCR方法。基于FHV-1的胸苷激酶(TK)基因、FCV的衣壳蛋白VP1基因、Bb的皮肤坏死毒素基因(DNT1)序列保守区域设计并合成TaqMan荧光定量PCR引物和探针,以FHV-1、FCV、Bb、猫细小病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌为模板验证引物和探针的特异性。制备重组质粒pMD18T-FHV-TK、pMD18T-FCV-VP1、pMD18T-Bb-DNT1作为标准品,经矩阵法确定最佳反应体系。以10倍梯度稀释的标准品为模板检测方法的灵敏性。应用建立的方法对32份临床具有上呼吸道感染症状的猫眼、口、鼻拭子检测,以评估该方法的可行性。结果显示:该方法可特异性检出FHV-1、FCV、Bb,且与猫细小病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌无交叉反应;灵敏度试验表明该方法对FHV-1、FCV、Bb的最低检出限分别为10、10和100拷贝/μL;应用该方法从32份猫临床样品中检测出FHV-1阳性11份、FCV阳性21份、Bb阳性4份,并经PCR测序验证。本研究初步建立了FHV-1、FCV、Bb多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,具有特异性强、敏感性高的特点,为临床猫上呼吸道疾病病原的分子检测提供参考。 展开更多
关键词 猫疱疹病毒Ⅰ型 猫杯状病毒 支气管败血波氏杆菌 TaqMan荧光定量PCR
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猫白血病C亚类病毒受体1的反义RNA1靶向抑制微小RNA-515-5p表达对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响
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作者 邱显本 尚海辉 +2 位作者 曾凡杨 胡婷婷 李晶 《中国耳鼻咽喉头颈外科》 CSCD 2021年第12期735-738,742,共5页
目的探讨猫白血病C亚类病毒受体1的反义RNA1(feline leukemia virus subgroup C virus receptor 1 antisense RNA 1,FLVCR1-AS1)对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制。方法以人永生化鼻咽上皮细胞NP69(简称NP69细胞)为对照,实... 目的探讨猫白血病C亚类病毒受体1的反义RNA1(feline leukemia virus subgroup C virus receptor 1 antisense RNA 1,FLVCR1-AS1)对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制。方法以人永生化鼻咽上皮细胞NP69(简称NP69细胞)为对照,实时荧光定量PCR(realtime fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)法检测鼻咽癌细胞系(5-8F、C666-1、6-10B)中FLVCR1-AS1和微小RNA(microRNA,miR)-515-5p表达。将C666-1细胞分为si-NC组、si-FLVCR1-AS1组、miR-NC组、miR-515-5p组、si-FLVCR1-AS1+anti-miR-NC组和si-FLVCR1-AS1+anti-miR-515-5p组,CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖,划痕实验和Transwell检测分别检测细胞迁移和侵袭。双荧光素酶报告基因实验验证FLVCR1-AS1和miR-515-5p调控关系。结果鼻咽癌细胞系(5-8F、C666-1、6-10B)中FLVCR1-AS1表达高于NP69细胞(2.26±0.11、4.19±0.24、3.54±0.18 vs 1.00±0.00,P<0.05),而miR-515-5p表达低于NP69细胞(0.86±0.09、0.20±0.03、0.47±0.05 vs 1.00±0.00,P<0.05)。与si-NC组比较,si-FLVCR1-AS1组C666-1细胞光密度(optical density,OD)值(0.59±0.03 vs 1.34±0.08)、克隆数[(55.67±1.70)个vs(114.67±3.30)个]、迁移距离[(75.34±3.09)μm vs(186.29±9.29)μm]、侵袭数[(69.33±3.68)个vs(149.67±6.80)个]降低(P均<0.05)。与miR-NC组比较,miR-515-5p组C666-1细胞OD值(0.51±0.04 vs 1.36±0.07)、克隆数[(46.67±1.25)个vs(115.67±4.11)个]、迁移距离[(65.89±1.96)μm vs(186.49±8.33)μm]、侵袭数[(58.33±2.05)个vs(150.00±6.98)个]降低(P均<0.05)。FLVCR1-AS1可靶向负调控miR-515-5p。与si-FLVCR1-AS1+anti-miR-NC组比较,si-FLVCR1-AS1+anti-miR-515-5p组C666-1细胞OD值(1.16±0.06 vs 0.59±0.04)、克隆数[(106.00±3.56)个vs(55.33±2.49)个]、迁移距离[(164.06±7.40)μm vs(75.48±2.62)μm]、侵袭数[(134.67±5.31)个vs(69.00±2.94)个]升高(P均<0.05)。结论 FLVCR1-AS1可能靶向下调miR-515-5p促进鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭。 展开更多
关键词 鼻咽肿瘤 细胞系 细胞增殖 细胞迁移分析 侵袭 猫白血病C亚类病毒受体1的反义RNA 1
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一株猫疱疹病毒Ⅰ型的分离与鉴定 被引量:3
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作者 许鑫燕 郑亚婷 +3 位作者 刘迪 马波 刘家森 曲连东 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1713-1720,共8页
采集哈尔滨某猫舍中表现为上呼吸道感染的患病猫眼、鼻拭子,PCR初步确诊为猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒(FHV-1)混合感染。利用猫肾细胞(CRFK)对样本进行病毒分离,前两代细胞培养物的核酸检测结果为FHV-1和FCV阳性,第三代开始只有FCV阳性... 采集哈尔滨某猫舍中表现为上呼吸道感染的患病猫眼、鼻拭子,PCR初步确诊为猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒(FHV-1)混合感染。利用猫肾细胞(CRFK)对样本进行病毒分离,前两代细胞培养物的核酸检测结果为FHV-1和FCV阳性,第三代开始只有FCV阳性,由此分离出FCV。制备此株FCV的鼠源多克隆抗体,并中和混合培养物中的FCV,从而分离出FHV-1,命名为HRB2019株。通过病毒粒子形态观察、间接免疫荧光试验(IFA)和基因序列分析等方法鉴定HRB2019株,并研究其体外生长动力学。结果显示,HRB2019株可在CRFK细胞上产生典型病变,测得其第四代病毒滴度为1×10^(8.43) TCID 50·mL^(-1);电镜下可观察到球形、有囊膜、直径约为200 nm的病毒粒子;IFA结果显示,分离株可与FHV-1阳性血清结合,出现特异性荧光;扩增分离株的gD基因,其与国内外流行株高度同源。病毒一步生长曲线表明,HRB2019株感染细胞12 h后开始复制增殖,12~36 h为快速增殖期,48~72 h进入增殖平台期且滴度达到高峰,84 h病毒滴度开始下降。本研究首次从FCV与FHV-1混合感染的病料中成功分离出FHV-1,为FHV-1的流行病学调查和病原学研究提供了重要数据,为混合感染中生长弱势毒株的分离提供了方法学依据。 展开更多
关键词 猫疱疹病毒 猫杯状病毒 分离 鉴定
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Role of Intracellular Distribution of Feline and Bovine SAMHD1 Proteins in Lentiviral Restriction
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作者 Chu Wang Lina Meng +8 位作者 Jialin Wang Kaikai Zhang Sizhu Duan Pengyu Ren Yingzhe Wei Xinyu Fu Bin Yu Jiaxin Wu Xianghui Yu 《Virologica Sinica》 SCIE CAS CSCD 2021年第5期981-996,共16页
Human SAMHD1(h SAM)restricts lentiviruses at the reverse transcription step through its d NTP triphosphohydrolase(d NTPase)activity.Besides humans,several mammalian species such as cats and cows that carry their own l... Human SAMHD1(h SAM)restricts lentiviruses at the reverse transcription step through its d NTP triphosphohydrolase(d NTPase)activity.Besides humans,several mammalian species such as cats and cows that carry their own lentiviruses also express SAMHD1.However,the intracellular distribution of feline and bovine SAMHD1(f SAM and b SAM)and its significance in their lentiviral restriction function is not known.Here,we demonstrated that f SAM and b SAM were both predominantly localized to the nucleus and nuclear localization signal(11KRPR14)-deleted f SAM and b SAM relocalized to the cytoplasm.Both cytoplasmic f SAM and b SAM retained the antiviral function against different lentiviruses and cytoplasmic f SAM could restrict Vpx-encoding SIV and HIV-2 more efficiently than its wild-type(WT)protein as cytoplasmic h SAM.Further investigation revealed that cytoplasmic f SAM was resistant to Vpx-induced degradation like cytoplasmic h SAM,while cytoplasmic b SAM was not,but they all demonstrated the same in vitro d NTPase activity and all could interact with Vpx as their WT proteins,indicating that cytoplasmic h SAM and f SAM can suppress more SIV and HIV-2 by being less sensitive to Vpx-mediated degradation.Our results suggested that f SAM-and b SAM-mediated lentiviral restriction does not require their nuclear localization and that f SAM shares more common features with h SAM.These findings may provide insights for the establishment of alternative animal models to study SAMHD1 in vivo. 展开更多
关键词 SAMHD1 feline SAMHD1(fSAM) Bovine SAMHD1(bSAM) Nuclear localization signal(NLS) VPX Degradation Viral restriction
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猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立与初步应用 被引量:8
14
作者 李航 刘俊平 +2 位作者 关平原 雷宇 李志 《动物医学进展》 北大核心 2017年第11期86-90,共5页
建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR检测方法,应用于临床样品中FHV-1的快速检测。根据猫疱疹病毒Ⅰ型的gI基因序列设计了一对特异性引物,以疑似猫疱疹病毒Ⅰ型感染猫的眼鼻分泌物总DNA为模板,建立了PCR检测方法,对所建立的方法进行特异性、... 建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR检测方法,应用于临床样品中FHV-1的快速检测。根据猫疱疹病毒Ⅰ型的gI基因序列设计了一对特异性引物,以疑似猫疱疹病毒Ⅰ型感染猫的眼鼻分泌物总DNA为模板,建立了PCR检测方法,对所建立的方法进行特异性、敏感性和重复性验证,并对26份临床样本进行检测。结果表明,所建立的PCR诊断方法与犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、绵羊肺炎支原体(M.ovis)、牛支原体(M.bovis)、牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)均无交叉性反应,最低检测DNA模板浓度为3.23×10~3 copies/μL。对26份临床病例进行检测,阳性率61.54%。说明建立的FHV-1PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、方便快捷等优点,适合于临床FHV-1感染的快速检测。 展开更多
关键词 猫疱疹病毒Ⅰ型 PCR检测
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虎源传染性鼻气管炎病毒gD基因重组真核表达载体的构建 被引量:5
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作者 张晓明 胡俊 +1 位作者 彭仕明 陈武 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第9期70-73,共4页
根据从虎气管组织扩增获得的猫传染性鼻气管炎病毒相关核酸序列,设计扩增编码虎源猫传染性鼻气管炎病毒gD蛋白基因片段的引物,通过PCR扩增出gD基因片段,并成功插入到pMD18-T Simple载体中,筛选获得重组质粒,命名为18T-gD。重组质粒通过H... 根据从虎气管组织扩增获得的猫传染性鼻气管炎病毒相关核酸序列,设计扩增编码虎源猫传染性鼻气管炎病毒gD蛋白基因片段的引物,通过PCR扩增出gD基因片段,并成功插入到pMD18-T Simple载体中,筛选获得重组质粒,命名为18T-gD。重组质粒通过HindⅢ和XhoⅠ酶切后,插入pcDNA 3.1(+)真核表达载体构建出gD基因的重组真核表达质粒pcDNA-gD。用脂质体将重组真核表达质粒pcDNA-gD转染293T细胞,通过RT-PCR和Western blot检测,结果显示gD基因在真核细胞中得到正确转录和表达,所表达蛋白分子质量约为42.29ku,为虎源猫传染性鼻气管炎基因疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 虎源传染性鼻气管炎病毒 GD基因 聚合酶链反应 真核表达
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猫疱疹病毒Ⅰ型实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用 被引量:13
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作者 王吉 卫礼 +5 位作者 付瑞 李晓波 王淑菁 巩薇 岳秉飞 贺争鸣 《中国比较医学杂志》 CAS 2014年第12期47-54,共8页
目的:建立猫疱疹病毒I型( FHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,应用于实验用猫及临床患猫FHV-1的快速检测。方法根据已发表的FHV-1 TK基因序列设计特异引物和TaqMan探针,使用分子生物学方法制备质粒标准品,建立FHV-1实时荧光定量PCR... 目的:建立猫疱疹病毒I型( FHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,应用于实验用猫及临床患猫FHV-1的快速检测。方法根据已发表的FHV-1 TK基因序列设计特异引物和TaqMan探针,使用分子生物学方法制备质粒标准品,建立FHV-1实时荧光定量PCR方法,并对方法的线性、特异性、敏感性、及稳定性等进行测定。用建立的方法对48份猫临床样品进行检测。结果成功建立FHV-1实时荧光定量PCR方法;该方法的线性范围为(1×102~1×109)copies/μL,与单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、犬疱疹病毒(CHV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猫细小病毒( FPV)均无交叉反应,检测灵敏度可达到10 copies/μL。批内变异系数均小于5%。应用该方法从48份猫临床样本中检测出33份FHV-1核酸阳性。结论建立的FHV-1PCR检测方法具有特异、敏感及稳定的特点,适合于临床FHV-1的快速定量检测。 展开更多
关键词 猫疱疹病毒Ⅰ型 实时荧光定量PCR
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猫疱疹病毒Ⅰ型的分离与鉴定 被引量:20
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作者 张硕 李纯玲 +2 位作者 汪葆玥 刘金华 田克恭 《实验动物科学》 2010年第2期21-25,共5页
目的从临床疑似猫病毒性鼻气管炎的病例中分离猫疱疹病毒Ⅰ型。方法用猫肾细胞(FK-81)对临床疑似猫病毒性鼻气管炎病猫的眼鼻分泌物进行分离培养,连续传4代,对获得的培养物进行了电子显微镜观察、血凝试验、病毒核酸型试验、理化特性试... 目的从临床疑似猫病毒性鼻气管炎的病例中分离猫疱疹病毒Ⅰ型。方法用猫肾细胞(FK-81)对临床疑似猫病毒性鼻气管炎病猫的眼鼻分泌物进行分离培养,连续传4代,对获得的培养物进行了电子显微镜观察、血凝试验、病毒核酸型试验、理化特性试验以及PCR扩增和扩增产物基因测序鉴定。结果该病毒粒子呈球形,直径为160 nm左右,有囊膜。凝集猫红细胞,不凝集猪、兔、犬、小鼠和鸡的红细胞。病毒对乙醚、酸、热、胰蛋白酶敏感,其核酸型属DNA。PCR扩增为猫疱疹病毒Ⅰ型阳性,扩增产物基因序列与Nunberg等报道猫疱疹病毒Ⅰ型的基因序列同源性为100%(登录号:M26660)。结论在国内首次成功分离一株猫疱疹病毒Ⅰ型,其形态、血凝性、理化特性、基因序列等与国外文献报道一致,为猫病毒性鼻气管炎病原学、疫苗免疫、诊断及分子生物学研究奠定基础。 展开更多
关键词 猫疱疹病毒Ⅰ型 FK-81细胞 病毒分离鉴定
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虎源猫传染性鼻气管炎病毒gD蛋白基因的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立 被引量:4
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作者 张晓明 陈武 +2 位作者 徐春忠 彭仕明 胡俊 《野生动物学报》 2014年第3期257-261,共5页
为研究虎源猫传染性鼻气管炎的快速诊断试剂盒和基因亚单位疫苗,根据Genbank公布的猫传染性鼻气管炎病毒的核酸序列,设计了关于虎源猫传染性鼻气管炎病毒gD蛋白基因的引物并利用PCR扩增出gD序列,成功插入到pMD18-T Simple载体中,筛选获... 为研究虎源猫传染性鼻气管炎的快速诊断试剂盒和基因亚单位疫苗,根据Genbank公布的猫传染性鼻气管炎病毒的核酸序列,设计了关于虎源猫传染性鼻气管炎病毒gD蛋白基因的引物并利用PCR扩增出gD序列,成功插入到pMD18-T Simple载体中,筛选获得重组质粒,命名为pmd-gD。将其利用HindⅢ和XhoⅠ酶切后,产物克隆入原核表达载体pet-32a(+)中,获得重组质粒,命名pet-gD。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot检测,结果显示目的基因在pET-32a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白相对分子质量约为60kDa,与虎源猫传染性鼻气管炎病毒阳性血清发生特异性反应。以纯化的表达产物作为包被抗原,建立了检测虎源猫传染性鼻气管炎抗体的间接ELISA检测方法。本实验为虎源性猫传染性鼻气管炎诊断试剂盒和基因亚单位疫苗的研究打下了重要的基础。 展开更多
关键词 虎源猫传染性鼻气管炎病毒 PCR 原核表达 间接ELISA
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猫疱疹病毒Ⅰ型US3基因剪接异构体的鉴定 被引量:1
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作者 孙雪 田进 +3 位作者 刘大飞 吴红霞 祖少坡 曲连东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期103-106,共4页
为鉴定猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)US3基因的编码产物,本研究以提取FHV-1感染细胞的总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增US3基因转录产物,测序结果显示除了全长US3基因(1 056 bp)外,还出现了一个825 bp的片段(US3-X1)。该片段是由全长US3基因在22... 为鉴定猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)US3基因的编码产物,本研究以提取FHV-1感染细胞的总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增US3基因转录产物,测序结果显示除了全长US3基因(1 056 bp)外,还出现了一个825 bp的片段(US3-X1)。该片段是由全长US3基因在226 bp^458 bp位置发生了自我剪接,导致234 bp DNA缺失而产生,但ORF并没有改变。此外,通过重叠延伸PCR将US3基因226 bp处碱基"A"突变为"G"(m US3),改变自我剪接位点。将全长US3基因、m US3和US3-X1基因分别克隆至p3×Flag-CMV-10中,转染F81细胞,经western blot检测表明FHV-1 US3可以表达两种不同分子量的异构蛋白,大小约为45 ku和50 ku。这种US3基因的剪接异构体现象在猪伪狂犬病毒和人单纯疱疹病毒中已有报道,而FHV-1 US3基因的剪接异构体的鉴定尚属首次。该研究结果为进一步研究FHV-1 US3异构体蛋白的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 猫疱疹病毒I型 US3基因 剪接异构体
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虎源传染性鼻气管炎病毒巢式PCR检测方法的建立 被引量:3
20
作者 李林翔 韦增晖 +2 位作者 张晓明 彭仕明 陈武 《野生动物学报》 北大核心 2015年第4期369-372,共4页
为了建立虎源传染性鼻气管炎病毒巢式PCR(nested PCR)的快速鉴定方法,根据虎源传染性鼻气管炎病毒(FHV-1)的gD蛋白基因序列设计套式引物,进行特异性、敏感性和重复性实验,特异性试验表明,该方法可以特异扩增出FHV-1的gD基因片断,从猫泛... 为了建立虎源传染性鼻气管炎病毒巢式PCR(nested PCR)的快速鉴定方法,根据虎源传染性鼻气管炎病毒(FHV-1)的gD蛋白基因序列设计套式引物,进行特异性、敏感性和重复性实验,特异性试验表明,该方法可以特异扩增出FHV-1的gD基因片断,从猫泛白细胞减少症病毒、猫支原体和阴性对照的VERO细胞均未扩增出该条带,敏感性试验表明,nested PCR检测极限是1×10~2 copies/μl,而一步法PCR的有效扩增最低极限是1×10~5 copies/μl,前者的敏感性明显高于后者,重复性实验表明,不同情况下3次重复性试验,结果相同。用nested PCR对疑似感染FHV-1的样品进行检测,实验结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究建立的nested PCR适用于野生猫科动物FHV-1感染的快速诊断与流行病学调查。 展开更多
关键词 虎源传染性鼻气管炎病毒 巢式PCR 一步法PCR GD基因
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