非标记探针HRM法在中国对虾EST-SNP筛选中的应用

利用高分辨率溶解曲线(High resolution melt,HRM),结合非标记探针技术,对中国对虾转录组EST测序序列中的118个候选SNP位点进行了位点多态性检测,获得了39个具有二等位基因多态性的SNP位点,占总候选位点的比例为33.1%。对这些SNP位点在一个48尾中国对虾群体中的多态性进行了分析,结果表明,观测杂合度Ho和期望杂合度He的分布范围分别为0.000～0.947和0.049～0.506,有效等位基因数分布范围为1.051～1.999,平均为1.574;多态信息含量分析显示39个位点的PIC值范围为0.0476～0.375,平均为0.272。另外,基因功能注释表明,39个多态SNP所在contig序列所对应的基因大都与免疫相关。以上这些结果表明,非标记探针HRM是一种简单快速而有效的SNP开发技术,可为中国对虾群体遗传学和遗传育种分析提供有效的候选标记。

基于转录组数据的大菱鲆(Scophthalmus maximus)SNP标记开发及多态性分析

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是最具商业价值和养殖前途的海水鱼类之一,雌雄间生长有一定的差异。其高通量雌雄转录组测序的完成为大规模鉴定和开发SNP标记提供了参考序列。本研究基于大菱鲆雌雄转录组测序数据,选择其中45个SNP位点,设计引物63组,其中21个位点(46.7%)应用小片段高分辨率熔解曲线(HRM)技术分型成功。对其进行多态性检测,21个位点均具有二个单倍型。观测杂合度Ho的分布范围为0.256—1.000,期望杂合度He的范围为0.276—0.518,19个位点符合Hardy-Weinberg平衡。14个SNP位点位于基因编码区,其中3个属于非同义突变。含有这些SNP位点的基因大多与信号转导和转录翻译相关。本研究结果表明,高通量转录组测序和小片段HRM适合大规模SNP标记开发,为大菱鲆的分子遗传育种提供了候选标记资源。

基于SNP标记的黄瓜杂交种纯度鉴定方法

根据国际葫芦科基因组数据库CuGenDB中序列信息,应用高分辨率熔解曲线技术筛选出用于黄瓜杂交种纯度鉴定的SNP位点CLA6(A/G),该位点在33个市售黄瓜品种中的多态信息量为0.401,处于中度多态;结合焦磷酸测序技术,建立基于CLA6位点的SNP-Pyrosequencing黄瓜杂交种纯度鉴定方法。利用该鉴定方法检测黄瓜杂交种优一90粒种子,结果其种子纯度为96.7%,该结果与CLA0位点及SSR鉴定结果相符,表明该鉴定技术适于黄瓜杂交种纯度鉴定,具有用于DUS测试分析的潜力。

基于高分辨率熔解曲线技术快速筛选黄瓜SNP_1

为筛选用以黄瓜纯度检验和品种鉴定的SNP位点,以17个黄瓜杂交品种及其34份亲本为SNP筛选群体,利用高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)技术筛选SNP位点。本研究通过HRM分析和焦磷酸测序确认,获得CLA0(TT/--)、CLA1(C/T)和CLA6(A/G)三个SNP位点,群体中多态信息量(PIC)分别为0.549、0.366和0.477;并对市售12个杂交黄瓜种分型鉴定,结果表明,三个SNP位点适用于其中11个市售品种的纯度鉴定,具备用于品种鉴定的潜能。

刺参(Apostichopus japonicus)重要经济性状相关SNP标记的验证分析

本研究在前期构建的刺参(Apostichopus japonicus)高密度遗传连锁图谱和QTL分析的基础上,筛选出26个与体长、体重、体宽、棘刺总数、抗病力相关的SNP位点,设计出可用于HRM检测的SNP扩增引物13对。在扩大群体中利用HRM小片段法对这13个刺参重要经济性状相关的候选SNP位点进行分型和多态性检测,并结合扩大群体的相关性状数据进行了QTL位点验证。多态性结果显示,13个位点中有3个单态性位点,其余10个多态性位点中有3个位点为低等位多态性,7个位点为中等位多态性。10个多态性位点的最小等位基因频率(MAF)介于0.016(SNP113)～0.332(SNP160)之间,平均值为0.173;各位点的观测杂合度(Ho)介于0.031(SNP113)～0.818(SNP9)之间,平均值为0.433;期望杂合度(H_o)介于0.031(SNP113)～0.834(SNP9)之间,平均值为0.402;多态信息含量(PIC)介于0.030(SNP113)～0.393(SNP160)之间,平均为0.248,有6个位点偏离HardyWeinberg平衡。QTL验证结果表明,SNP40和SNP160位点为与生长(体长、体重、体宽)相关的位点,各位点的优势基因型分别为SNP40(CC)和SNP160(AA);SNP88、SNP112和SNP126这3个位点为与抗病力相关的位点,各位点的优势基因型为SNP88(CC)、SNP112(AA)和SNP126(TT)。基于这5个位点构建生长和抗病二倍型,发现二倍型K_1(CC AA TT)抗病力最强,S_1(CC AA)、S_3(CC AC)在生长方面优势显著,相关研究结果可为分子标记辅助育种在生产中应用提供基础数据。

应用SNP标记高效鉴定黄瓜杂交种纯度

以71个市售黄瓜品种为材料,应用高分辨率熔解曲线技术筛选可用于黄瓜纯度检验和品种鉴定的SNP位点,并通过焦磷酸测序验证,得到14个SNP位点,这些位点在71个市售黄瓜品种中的多态信息量为0.079～0.528。为确保结果的准确性,利用该鉴定方法检测黄瓜杂交种F1的94粒种子,结果显示,Chr0108等6个SNP位点检测的种子纯度均为100%,且鉴定结果与SSR标记检测方法相符。表明,对供试样品同时进行这6个SNP位点的检测分析,能够更加可靠、准确、高效地鉴定其纯度,并可用于DUS测试分析,为今后葫芦科作物的品种审定和新品种保护等工作奠定基础。

基于SNP标记的黄瓜遗传多样性分析

通过查询NCBI、葫芦科基因组网站数据库获得42个黄瓜候选SNP位点。应用高分辨率溶解曲线技术对71个市售黄瓜品种进行SNP位点筛选,并通过焦磷酸测序进行SNP基因分型分析,探索SNP标记在黄瓜品种鉴定中的应用前景。结果表明:42个SNP位点中有30个位点的多态信息量为0.027-0.528,平均为0.247;71个黄瓜品种两两间的遗传相似系数分布在0.4032-0.9839,即30个SNP位点的基因分型数据信息可以将71份黄瓜品种区分开。

高分辨率熔解曲线HRM在SNP检测中的应用

自然界生物具有丰富多样性,其本质在于DNA序列的多样性,单核苷酸多态性(SNP)是DNA序列多样性的基本单位,亦为生物进化和选择的动力源。越来越多的研究表明,SNP与人类的疾病、动植物的生长性状显著相关,对SNP的检测亦逐渐成为疾病检测和生物分子育种的重要手段。与传统的SNP检测技术相比较,高分辨率熔解曲线(HRM)具有高通量、高灵敏度、高特异性、快速、操作简单和重复性好的特点,能够快捷、有效筛查生物群体中的SNP位点,将逐渐成为SNP检测的主流技术。本文对HRM原理、方法、特点和应用进行综述,以飨读者。

RTKN2、LDLR、APOB和APOC1基因多态性与类风湿性关节炎的相关性

目的:建立RTKN2基因rs3125734 C> T、LDLR基因rs688 C> T、APOB基因rs693 C> T和APOC1基因rs4420638 A>G四个SNP位点的PCR-HRM分子诊断方法,并研究其与兰州地区汉族人群类风湿关节炎易感的相关性。方法:通过设计引物和PCR-HRM检测体系优化,建立四个SNP位点的基因分型方法。检测588例RA患者和200例健康对照者标本,通过病例对照研究分析其RA易感性。结果:经测序验证所建PCR-HRM检测方法的正确性。结果显示,rs3125734和rs688位点的基因型和等位基因频率在RA组和对照组间存在统计学差异(P分别为0. 046和0. 016、0. 014和0. 02),rs3125734杂合突变型CT在RA组与对照组间差异有统计学意义(χ~2=4. 013,P=0. 045,OR=1. 613,95%CI:1. 010-2. 576),rs688纯合突变型TT在两组间有显著差异(χ~2=6. 853,P=0. 009,OR=0. 273,95%CI:0. 103-0. 721)。rs693和rs4420638位点基因型和等位基因频率在RA组和对照组间差异无统计学意义(P>0. 05)。经RF和anti-CCP将RA组分层后,rs4420638位点基因型和等位基因频率在RF(-) RA组与对照组间有统计学差异(χ~2=4. 710,P=0. 030;χ~2=4. 110,P=0. 043),其杂合突变型AG在两组间存在显著差异(χ~2=4. 046,P=0. 044,OR=1. 799,95%CI:1. 015-3. 186); rs693在各组间无显著差异(P> 0. 05)。构建rs688和rs4420638单倍型,单倍型CA和TA在RA组和对照组间有显著差异(P=0. 020,OR=1. 408,95%CI:1. 054-1. 881; P=5. 73×10-5,OR=0. 443,95%CI:0. 295-0. 664)。结论:建立的rs3125734、rs688、rs693和rs4420638位点PCR-HRM分子诊断方法可用于常规化检测。rs3125734、rs688和rs4420638位点是兰州地区汉族人群的RA易感基因,rs3125734位点CT基因型和rs4420638位点AG基因型是RA发病的危险因素,而rs688位点TT基因型是RA的保护性因素。rs688和rs4420638的单倍型CA可显著增加RA的发病风险,TA可降低RA的发病风险。

栉孔扇贝转录组来源单核苷酸多态性位点的多态性分析

应用高分辨率熔解曲线技术对栉孔扇贝转录组来源的单核苷酸多态性位点进行验证分型和多态性分析。根据栉孔扇贝转录组单核苷酸多态性位点序列信息,对其中150个位点设计引物和探针,在4个栉孔扇贝野生群体中进行验证分型。其中,103对引物扩增出目的产物,76个位点成功分型,58个多态位点中51个是二等位多态性单核苷酸多态性(34.0%)。进一步在荣成野生群体中对51个二态单核苷酸多态性位点进行多态性验证和群体遗传学分析,其中49个位点呈现多态性,且均为二态,最小等位基因频率为0.0610～0.5000,观测杂合度和期望杂合度分别为0.0833～0.8889和0.0833～0.5833。经Boferroni校正,有2个位点(C1630S115_AG和C19848S286_CA)在该群体中偏离Hardy-Weinberg平衡。各位点之间未检测到连锁不平衡。这些多态单核苷酸多态性位点可用于栉孔扇贝连锁图谱构建、分子标记辅助育种以及数量性状的基因定位等遗传学研究。

应用高分辨熔解曲线技术检测先天性巨结肠症患儿RET基因单核苷酸多态性

目的研究山西汉族人群先天性巨结肠症(Hirschsprung's disease,HSCR)患者RET基因A45A,L125L,G691S的基因多态性的基因型和等位基因频率,探讨其基因多态性与HSCR发病的关系。方法应用高分辨率熔解曲线技术(High Resolution Melt,HRM)以及产物测序,序列比对的方法,对山西省80例散发性先天性巨结肠症患儿和80例健康儿童进行RET基因A45A,V125V,G691S位点分析。结果 A45A位点存在多态性,病例组突变型A和野生型G等位基因频率为84.37%和15.63%;对照组中突变型A和野生型G等位基因频率为47.50%和52.50%。与对照组相比两组间等位基因差异显著(χ2=48.43,P<0.05)。风险等位基因为A等位基因,OR=5.97,95%可信区间为3.609～9.874。G691S病例组突变型A和野生型G等位基因的频率为8.12%和91.88%;在对照组突变型A和野生型G等位基因频率为5.62%和94.38%,两组比较差异无明显差异(χ2=0.7810,P>0.05)。V125V可能不存在基因多态性。结论在山西汉族人群中,RET基因A45A多态性与先天性巨结肠症显著相关,未发现G691S与HSCR存在相关性,V125V可能不存在基因多态性。