桑树阿槐酸5-羟化酶基因的克隆及遗传转化

阿槐酸5-羟化酶(ferulic acid 5-hydroxylase,F5H)是催化S木质素合成的关键酶。为研究桑树F5H对S木质素合成的影响,从野生川桑中克隆得到一个阿槐酸5-羟化酶基因,命名为MnF5H(GenBank登录号:KC152637)。该基因ORF为1 515 bp,编码504个氨基酸,预测蛋白质分子质量56.77 kD,等电点6.45,具有细胞色素P450单加氧酶保守结构域。系统进化树中,MnF5H蛋白与来源于桑科构属的光叶楮的同源蛋白聚在一起,表明阿槐酸5-羟化酶在进化上具有保守性。通过荧光定量PCR检测到MnF5H基因在木质化的桑树根部高量表达,暗示该基因与木质素的形成密切相关。在烟草中超量表达MnF5H基因,经组织化学染色发现S木质素合成增加,G木质素合成减少,但木质素总含量基本不变。研究结果表明该基因在控制S木质素的合成中起关键作用。

3-[(3-甲氧基-4-乙酰氧基-5-溴)苯基]丙烯酸的合成

目的:合成3-[(3-甲氧基-4-乙酰氧基-5-溴)苯基]丙烯酸。方法:以香草醛为原料,经溴代、Knoevenagel反应、乙酰化得到目标化合物。结果与结论:目标化合物结构经元素分析、IR的验证,其未见文献报道。

1-(5′-溴阿魏酰基)-4-(2′-氯)苄基哌嗪盐酸盐的合成及表征

以5′-溴阿魏酸为原料,通过酚羟基的乙酰化保护、羧酸羟基氯代、酰化、脱乙酰基、成盐,制备出的标题化合物为新化合物,未见文献报道,其结构经IR、1HNMR、MS及元素分析确证。

高效液相色谱法测定蒙药嘎古拉-5散中阿魏酸的含量

目的:建立蒙药嘎古拉-5中阿魏酸的含量测定方法。方法:采用高效液相色谱法(HPLC),色谱柱为Diamonsil C18色谱柱(250mm x4.6mm,5μm);流动相为乙腈-0.085%磷酸溶液(14:86);流速1.0m L·min^(-1);检测波长为316nm。结果:阿魏酸在1.584μg·m L^(-1)~15.84μg·m L^(-1)浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系,r=0.9999,平均加样回收率98.89%,RSD为1.56%。结论:本方法简便准确,重复性好,可用于测定蒙药嘎古拉-5中阿魏酸的含量测定。

阿魏酸结合吡咯啉-5-羧酸还原酶1抑制乳腺癌细胞增殖

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一,严重威胁女性健康。天然产物因其结构多样、毒副作用低及作用机制独特等优势已然成为开发抗肿瘤药物的主要来源。以人乳腺癌细胞MCF-7和小鼠乳腺癌细胞4T1为研究对象,探索植物源多酚类物质阿魏酸(ferulic acid,FA)对乳腺癌细胞的影响。细胞存活实验和克隆形成实验表明,阿魏酸可以抑制MCF-7和4T1细胞的存活和增殖,且抑制效应具有浓度依赖性。通过Pull-down、银染和LC-MS-MS质谱鉴定分析发现,FA与蛋白质吡咯啉-5-羧酸还原酶1(pyrroline-5-carboxylate reductase 1,PYCR1)有直接相互作用。PYCR1体内能通过酶促反应催化脯氨酸代谢合成,发挥促进肿瘤生长和增殖的作用。使用Autodock Vina和PyMOL软件模拟分子对接,结果显示,FA与PYCR1的246位谷氨酸和251位精氨酸存在相互作用;通过酶活力检测证实,FA靶向结合PYCR1且以浓度依赖性的方式抑制其酶活性;通过分析人类肿瘤基因图谱(TCGA)发现,PYCR1在乳腺癌患者中的表达显著高于健康对照人群(P<0.0001),且高表达的PYCR1与临床不良预后高度相关。

四物汤中四种成分的含量测定研究

目的建立四物汤中没食子酸、5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸的含量测定方法。方法采用HPLC法,色谱柱为ZorbaxSB-Aq;流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液(梯度洗脱);没食子酸、芍药苷的检测波长为230nm,5-羟甲基糠醛的检测波长为280nm,阿魏酸的检测波长为316nm;流速为1mL·min-1;柱温为40℃。结果没食子酸、5-羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸的线性范围分别为0.0247～0.4944μg(r=0.9992)、0.01996～0.7984μg(r=0.9999)、0.1181～2.362μg(r=0.9997)、0.1262～0.5048μg(r=0.9996),加样回收率分别为100.22%(RSD=2.06%)、99.83%(RSD=2.70%)、101.37%(RSD=1.59%)、99.89%(RSD=2.29%)。结论四物汤中没食子酸与芍药苷来自白芍,5-羟甲基糠醛来自熟地黄与川芎,阿魏酸来自当归与川芎,为四物汤物质基础的研究提供了一定的参考。

RP-HPLC法同时测定四物汤中4种活性成分的含量

目的建立一种高效液相色谱法同时测定四物汤中5-羟甲基糠醛、川芎嗪、芍药苷、阿魏酸四种活性成分的含量。方法采用Phenomenex luna C18(250mm×4.6mm,5.0μm)色谱柱,流动相:乙腈(A)-0.05%甲酸水溶液(B),线性梯度洗脱(0~5min,A相5%;5~10min,A相5%→10%;10~20min,A相10%→20%;20~40min,A相20%→30%;40→46min,A相30%→5%);流速:1.0mL·min^(-1);检测波长:230nm和282nm。柱温:35℃。结果 5-羟甲基糠醛、川芎嗪、芍药苷、阿魏酸分别在0.0215~0.43mg·mL^(-1)、0.021~0.42mg·mL^(-1)、0.0195~0.39mg·mL^(-1)、0.023~0.46mg·mL^(-1)范围内呈良好线性关系。四物汤中5-羟甲基糠醛、川芎嗪、芍药苷、阿魏酸四种有效成分的含量分别为0.0681%、未检出、0.250%、0.0358%。结论该方法操作简便,结果准确可靠。

液质联用法测定川芎茶调丸中阿魏酸等6种成分的含量

目的:以液质联用法对川芎茶调丸中阿魏酸、欧前胡素、异欧前胡素、细辛脂素、升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷6种成分的含量进行测定。方法:采用液相色谱串联三重四级杆质谱进行测定。色谱柱:Agilent Poroshell 120 SB C_(18)(2.1 mm×100 mm,2.7μm);流动相:0.1%甲酸乙腈-5 mmol·L^(-1)甲酸铵溶液(40∶60);流速:0.3 mL·min^(-1);电喷雾离子源(ESI),正负离子模式,采用多反应监测模式(MRM)测定。结果:上述6种成分在对应的浓度范围内呈良好的线性关系;加样回收率为98.14%～99.63%,RSD为0.55%～1.42%(n=6)。结论:本法快速、准确、可靠,可同时测定该丸中6种成分,为该制剂的质量控制提供理论依据。

HPLC法测定补气生血口服液中三种组分的含量

目的建立以高效液相色谱测定补气生血口服液中黄芪甲苷、二苯乙烯苷和阿魏酸含量的方法。方法三组分均采用phenomenex C_（18）（250 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱;黄芪甲苷测定的流动相为水-乙腈（60：40）;柱温：30℃;流速：1.0 mL/min;进样量：10μL;ELSD检测器;漂移管温度：105℃;气流速度：2.5 L/min。二苯乙烯苷与阿魏酸测定流动相为乙腈-水（20：80）;流速1.0 mL/min;检测波长：248 nm;柱温30℃。结果补气生血口服液中黄芪甲苷在0.22~5.72μg/mL范围内线性关系良好,加样回收率为91.2%。在相同色谱条件下,二苯乙烯苷与阿魏酸分离度好,二苯乙烯苷在9.83~393.00μg/m L范围内、阿魏酸在1.015~50.756μg/mL范围内线性关系良好,加样回收率分别为90.7%和92.8%。结论该方法简便、快捷、专属性强,为其质量控制与含量测定提供了重要参考。

HPLC同时测定都梁滴丸中的阿魏酸、5-甲氧基补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素

目的:建立一种同时测定都梁滴丸中的阿魏酸、5-甲氧基补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素含量的方法。方法:都梁滴丸以75%甲醇超声提取30 min后取上清液,采用Agilent Zorbax SB C18(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱,以甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱,流速1.0 mL.min-1;检测波长分别为254,320,330 nm。结果:4种成分的方法最低定量限为3～15 mg.kg-1,线性范围0.5～50 mg.L-1,相关系数(r2)≥0.999 5。高、中、低3个添加水平的平均加样回收率(n=5)为96.6%～102.5%,RSD 0.16%～2.07%。结论:该方法简便、快速适用于都梁滴丸中阿魏酸、5-甲氧基补骨脂素、欧前胡素和异欧前胡素的含量测定。

HPLC同时测定正天丸中芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量

该研究以高效液相色谱同时测定正天丸(钩藤、白芍、川芎、当归、防风等)中芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量。试验中采用Insertil ODS-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL.min-1,柱温30℃,检测波长230 nm。由试验结果可知,芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷在11.37～170.5,2.188～32.82,2.896～43.44,3.000～45.00 mg.L-1峰面积与进样量线性关系良好,r分别为0.999 9,0.999 9,1.000 0,1.000 0;回收率(n=6)分别为102.3%(RSD 1.2%),99.71%(RSD 1.9%),101.2%(RSD 1.2%),99.40%(RSD 2.4%)。按所建方法对5批样品中上述4种成分的含量进行测定,结果均令人满意。该方法简便、准确,重复性好,可用于正天丸中芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的质量控制。

HPLC法测定养血生发胶囊中5种活性成分

目的建立HPLC法同时测定养血生发胶囊中阿魏酸、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、羌活醇、异欧前胡素和大黄素5种活性成分的方法。方法安捷伦EclipseXDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈-0.1%冰醋酸,采用梯度洗脱;检测波长:310nm;体积流量:1mL/min;柱温:30℃;进样量:20μL。结果 5种成分均达到基线分离,各成分均有较宽的线性范围和良好的线性关系,其平均回收率分别为95.68%、100.02%、100.55%、103.03%、100.07%。结论该方法简便、灵敏、准确,在同一色谱检测条件下实现多指标成分同时测定,为养血生发胶囊的质量评价和控制提供新的方法。

RP-HPLC法同时测定十味活血丸中阿魏酸、橙皮苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量

目的:建立同时测定十味活血丸中阿魏酸、橙皮苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷3种活性成分含量的RP-HPLC法。方法:采用Diamonsil C18(200mm×4.6mm,5μm)色谱柱;以甲醇-0.05%醋酸-四氢呋喃(34∶65∶0.2)为流动相;流速1.0mL.min-1;柱温35℃;检测波长320nm。结果:阿魏酸、橙皮苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷浓度分别在1.80～18.0,40.0～400,3.00～30.0μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系(r>0.9995,n=6);方法平均回收率(n=9)分别为101.6%,99.9%,98.0%。结论:本法简便、准确,重复性好,可为十味活血丸质量评价提供依据。

基于HPLC指纹图谱结合化学模式识别及多指标成分定量评价香附质量

目的采用指纹图谱结合化学模式识别评价不同产地香附Cyperus rotundus及其炮制品的质量并进行化学成分含量测定。方法采用Venusil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相,进行梯度洗脱。结合聚类分析(hierarchical cluster analysis,HCA)、主成分分析(principal component analysis,PCA)及正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)进行评价。对样品中5-羟甲基糠醛(5-HMF)、对香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、α-香附酮6个成分进行定量分析。结果建立不同产地香附、醋香附、酒香附、四制香附的高效液相指纹图谱,60批样品共标定17个共有峰,指认出6个成分,3号峰为5-HMF,7号峰为对香豆酸,8号峰为阿魏酸,14号峰为木犀草素,19号峰为香附烯酮,21号峰为α-香附酮。PCA分析结果、OPLS-DA分析结果与聚类分析结果显示,香附、醋炙香附、醋煮香附、醋蒸香附、醋煮蒸香附存在一定差异。以VIP>1为标准筛选贡献较大的差异性成分,筛选出6、5、7(对香豆酸)、15、14(木犀草素)、8、1号峰为差异标志物,提示在香附及其炮制品质量分析中应重点关注以上成分,含量测定结果表明不同产地香附及其炮制品之间存在一定差异。结论建立的香附HPLC指纹图谱操作简便、结果可靠,5-HMF、对香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、α-香附酮可以作为香附质量评价的指标性成分。

基于基准关联度和熵权-优劣解距离法综合评价优选经典名方羌活胜湿汤提取工艺

目的应用正交试验设计并结合基准关联度和熵权-优劣解距离(technique for order preference by similarity to an ideal solution,TOPSIS)模型筛选羌活胜湿汤现代提取工艺。方法以加水倍数、提取时间、提取次数为考察因素进行正交试验设计制备9份样品,以样品中升麻素苷、阿魏酸、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸、羌活醇、蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯含量和指纹图谱相似度以及干膏率作为评价指标,计算各样品指标基准关联度,用于熵权法计算以确定各指标所占权重,计算综合评分,采用TOPSIS模型计算样品与基准样品的相对接近度,并进行排序,结合综合评分筛选最佳提取工艺。结果通过熵权-TOPSIS模型确定最佳提取工艺为加10倍水,提取2次,每次提取30 min,3批验证样品综合评分均值为85.53%,RSD值为1.74%,工艺稳定可行。结论结合基准关联度和熵权-TOPSIS模型的综合策略可用于优选经典名方现代提取工艺,且工艺稳定可靠,该策略可为其他经典名方制剂研究提供参考。

基于网络药理学整合体内实验探究四物汤单味药组分治疗胆汁淤积性肝损伤的作用与机制

目的基于网络药理学整合体内实验对比四物汤中4种单味药(川芎Chuanxiong Rhizoma、白芍Paeoniae Radix Alba、当归Angelicae Sinensis Radix、熟地黄Rehmanniae Radix Praeparata)治疗胆汁淤积性肝损伤(cholestatic liver injury,CLI)的药效差异,并探讨各单味药的作用机制。方法利用TCMSP数据库获取川芎、白芍、当归、熟地黄的主要活性成分及作用靶点,通过GeneCards数据库获取CLI靶点,使用Cyctoscape 3.10.1软件分析并构建“单味药-活性成分-作用靶点”网络,借助在线网站获取各单味药与CLI之间的交集靶点,并绘制韦恩图。将靶点基因导入DAVID数据库进行基因富集分析。构建胆总管结扎(bile duct ligation,BDL)动物模型,给予各单味药水提物后,检测血清肝功能相关生化指标,并对肝组织进行病理染色对比药效作用。同时结合qRT-PCR检测CLI相关靶点的基因表达。结果网络药理学结果显示,四物汤中川芎、白芍、当归、熟地黄与CLI之间均存在3个交集靶点[核受体亚家族3C组成员2(nuclear receptor subfamily 3 group C member 2,Nr3c2)、类视黄醇X受体(retinoid X receptor alpha,Rxra)、前列腺素内过氧化物合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,Ptgs2)]。通过体内验证实验表明白芍、川芎、当归、熟地黄水提物均可显著改善CLI以及相关的肝纤维化情况,且均能下调上述3个共同靶点表达(P<0.05、0.01、0.001)。此外,白芍、川芎的体内抗CLI疗效优于当归、熟地黄提取物。结果还显示白芍与CLI有18个、川芎与CLI有4个与其他单味药不同的独立交集靶点,而当归、熟地黄与CLI之间不存在独立的交集靶点。进一步生信分析发现,白芍作用靶点基因富集于血管生成、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路;川芎作用靶点富集于血管内皮、血管生成、血管生成因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通路。进一步验证结果显示白芍通过下调肝脏中血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule 1,Vcam1)、Tnf、有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase 8,Mapk8)、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT serine/threonine kinase 1,Akt1)表达改善CLI,川芎通过下调肝脏激酶插入结构域受体(kinase insert domain receptor,Kdr)、Mapk14表达改善CLI。结论四物汤中川芎、白芍、当归、熟地黄均能不同程度地改善胆汁淤积引起的肝损伤及纤维化,它们通过靶向Nr3c2、Rxra、Ptgs2共同改善CLI。白芍、川芎改善CLI疗效优于当归、熟地黄,前者可基于TNF信号通路而后者则是通过调控VEGF信号通路分别特异性改善CLI。

基于特征图谱及高效液相色谱波长切换法同时测定当归饮子中6种成分

目的:建立当归饮子物质基准特征图谱和6种成分含量测定方法,以期为当归饮子物质基准的质量评价研究提供参考。方法:使用不同批次饮片制备15批当归饮子物质基准,利用高效液相色谱波长切换法建立当归饮子特征图谱,并进行特征峰归属和相似度分析;以绿原酸、芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸铵6种成分作为指标性成分建立当归饮子多成分含量测定方法,检测波长依次是绿原酸327 nm、升麻素苷254 nm、芍药苷230 nm、阿魏酸316 nm、5-O-甲基维斯阿米醇苷254 nm、甘草酸铵237 nm,流速为1.0 mL/min,柱温为30℃,进样量为10μL。结果:15批当归饮子物质基准特征图谱共有9个特征峰,共指认出绿原酸、芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸铵6个色谱峰,相似度均>0.95;精密度、稳定性(24 h)、重复性试验的RSD均<2%(n=6);平均加样回收率均>98%(RSD<2%,n=9)。结论:建立的当归饮子物质基准特征图谱和含量测定方法简单易行,结果准确,重复性稳定性良好,可为当归饮子物质基准的质量评价提供参考。

基于HPLC指纹图谱、多成分定量结合化学计量学方法评价不同产地三棱药材的质量

目的基于HPLC指纹图谱、多成分定量与化学计量学相结合的方法建立不同产地三棱质量评价方法。方法采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)对7省12批不同产地的三棱药材的HPLC指纹图谱进行相似度评价;通过对照品比对指认9种化学成分,并测定样品中9种成分含量;使用SPSS 20.0软件进行聚类分析和主成分分析。结果选取了12个色谱峰作为指纹图谱共有峰,12批样品的相似度计算结果均大于0.800,说明各产地的药材有较好的一致性;测定了5-羟甲基糠醛、香草酸、阿魏酸、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、香兰素、原儿茶酸、对香豆酸、异阿魏酸9种成分的含量;通过聚类分析可将12批样品聚为4类;主成分分析用4个主成分对三棱药材进行综合评价,综合得分结果显示,河南新乡、江苏镇江、河北沧州、湖南岳阳、浙江金华、河南郑州的三棱药材在所有样品中的综合得分位于前6名;12批饮片主成分综合得分与含量测定结果存在相关性。结论建立的三棱质量评价方法操作简便、重复性好、结果可靠,可用于全面评价三棱药材的质量。

穿心莲化学成分的研究(Ⅱ)

目的研究穿心莲Andrographis paniculata地上部分的化学成分。方法采用反相硅胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、反相制备高效液相色谱等技术对穿心莲水提取物进行分离纯化,并根据理化性质和波谱学手段进行结构鉴定。结果从穿心莲地上部分70%乙醇浸膏的水提物中分离得到15个化合物,分别鉴定为5,4′-二羟基-7-甲氧基-8-O-β-D-葡萄糖黄酮苷(1)、芹菜素(2)、木犀草素(3)、6,8-二-C-β-D-葡萄糖白杨素(4)、异高黄芩素(5)、5-咖啡酰基奎宁酸(6)、3,4-二咖啡酰基奎宁酸(7)、3,4-二咖啡酰基奎宁酸甲酯(8)、3,4-二咖啡酰基奎宁酸丁酯(9)、4,5-二咖啡酰基奎宁酸甲酯(10)、咖啡酸(11)、对羟基桂皮酸(12)、阿魏酸(13)、原儿茶酸(14)、富马酸单乙酯(15)。结论化合物4～6、9、10、14、15为首次从穿心莲属植物中分离得到。

不同采收期苍耳草中酚酸类及蒽醌类成分的动态积累分析

目的分析不同采收期苍耳草Xanthium sibiricum中酚酸类及蒽醌类成分的动态变化。方法采用HPLC法测定不同采收期苍耳草中酚酸类成分绿原酸、新绿原酸、原儿茶醛、原儿茶酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、阿魏酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸及蒽醌类成分芦荟大黄素、大黄素、大黄酚的量。结果不同采收期苍耳草中酚酸类及蒽醌类成分的量呈动态变化,总酚酸量7月中旬较高,总蒽醌量7月下旬较高;绿原酸、原儿茶醛、阿魏酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸5种主要酚酸总量7月中旬较高,其中绿原酸量以6月下旬较高,其余均以7月中旬较高。结论为确定苍耳草药材的适宜采收期提供依据。