氟诺哌齐对新西兰家兔胚胎-胎仔发育毒性及毒代动力学

目的研究氟诺哌齐(fronopezil)对新西兰家兔胚胎-胎仔发育的影响及其伴随毒代动力学,为临床用药提供参考。方法按妊娠顺序将孕兔分为溶媒(1%羟丙基甲基纤维素+1.5%聚乙二醇400水溶液)对照组、环磷酰胺(18 mg·kg^(-1),阳性对照)组及氟诺哌齐3.6,9.0和22.5 mg·kg^(-1)组。溶媒对照组和氟诺哌齐组于妊娠第6~18天(GD6-18)ig给药,环磷酰胺组于GD6-20 ig给药。GD_(28)处死孕兔,检测胚胎-胎仔发育,ELISA检测GD5,GD_(18)和GD_(28)孕兔血清中性激素水平,首末次给药前后采血进行伴随毒代动力学研究,采用高效液相色谱串联质谱法检测血浆、胎仔、胎盘和羊水中的药物浓度。结果氟诺哌齐3.6,9.0和22.5 mg·kg^(-1)对孕兔的体重、增重、摄食量和妊娠结局及胎仔的外观、内脏、骨骼和体格生长发育均未见明显影响;仅在GD_(18)或GD_(28)各剂量组卵泡刺激素、雌二醇和孕酮水平有一定程度波动。伴随毒代动力学研究结果表明,氟诺哌齐可通过胎盘屏障,但在孕兔和胎仔体内无明显蓄积;环磷酰胺组胎仔体重、顶臀长和连胎子宫重均低于溶媒对照组(P<0.01),外观和骨骼均出现畸形。结论氟诺哌齐对新西兰家兔胚胎-胎仔发育毒性的未见有害作用剂量为22.5 mg·kg^(-1),为药效起效剂量的125倍,该剂量下GD_(18)血药峰浓度为1093μg·L^(-1),药时曲线下面积为6650μg·h·L^(-1)。

兔胚胎-胎仔发育毒性实验阳性模型的建立

目的探讨兔胚胎-胎仔发育毒性实验中,经口灌胃环磷酰胺建立兔致畸实验模型的方法,为致畸实验研究提供实验室背景数据。方法取健康受孕的普通级新西兰兔66只,按动物体质量采用随机数字法分为溶酶对照组(0.5%羧甲基纤维素钠)和环磷酰胺染毒组(20 mg/kg),交配成功后于孕兔GD 6~GD 18按2 mL/kg进行灌胃染毒。染毒期间观察临床表现,统计孕兔的体质量、成功受孕率、黄体数、活胎数、死胎数和吸收胎数等指标,记录胎仔的体质量、身长、外观畸形、内脏畸形和骨骼畸形等指标。结果环磷酰胺组孕兔的体质量和溶酶对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);环磷酰胺组孕兔黄体数、活胎数和着床数与溶酶对照组相比均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);环磷酰胺组胎仔的重量、身长和胎盘重量与溶酶对照组相比均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);环磷酰胺组胎仔的外观、内脏和骨骼的异常发生率明显升高,与溶酶对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结论环磷酰胺经口灌胃染毒,在20 mg/kg的灌胃剂量下,给药周期短,胎仔的畸形率高,畸形种类多,不引起母体毒性,可建立较好的兔胚胎-胎仔发育毒性实验模型。

TGF-β对胎兔颅骨成骨样细胞体外成骨作用

目的 :探讨TGF β对胎兔颅骨成骨样细胞体外成骨作用。方法 :显微相差动态观察、细胞增殖计数、ALP活性测定及骨结节计数观察TGF β体外成骨作用。结果 :TGF β对该细胞的增殖 ,低剂量有促进作用 ,高剂量有抑制作用。TGF β(在 3～ 7d)对ALP活性有促进作用 ,并呈一定的时效和量效关系。TGF β低剂量对骨结节形成有促进作用 ,高剂量时为强有力的抑制作用 ,与剂量有相关关系。结论 :TGF β对胎兔颅骨成骨样细胞体外成骨表现为双相作用。

胎兔骨髓基质前成骨细胞的培养及鉴定

为了证实体外培养的胎兔骨髓基质骨祖细胞具有成骨细胞系特征。采用胎兔长管骨骨髓细胞 ,加入 DMEM培养 ,传代四代后 ,用活体相差显微镜、透射电镜、组织化学染色、免疫组化等方法进行观测。结果显示体外培养的基质细胞具有成骨细胞系特征。提示胎兔骨髓基质骨祖细胞 ,可以作为修复骨缺损的种子细胞。

TGF-β对胎兔颅骨成骨样细胞体外成骨作用及BMP蛋白表达影响的研究

目的 探讨TGF β对胎兔颅骨成骨样细胞体外成骨作用及BMP蛋白表达的影响。 方法 采用ALP活性测定及骨结节计数方法观察TGF β对胎兔颅骨成骨样细胞体外的成骨作用 ,BMP McAb免疫组化染色及其定量分析观察TGF β对胎兔颅骨成骨样细胞BMP蛋白表达的影响。结果 TGF β( 3～ 7d)对ALP活性有促进作用 ,并呈一定的时效和量效关系。TGF β对骨结节形成低剂量时有促进作用 ,高剂量时有较强的抑制作用 ;TGF β对成骨细胞BMP蛋白表达表现为抑制作用 ;二者均有显著性差异。 结论 TGF β对胎兔颅骨成骨样细胞体外成骨及BMP蛋白表达表现为双相作用。

胎兔皮肤无瘢痕愈合相关蛋白的筛选与初步分析

目的:筛选胎兔皮肤组织无瘢痕愈合相关蛋白,并初步分析其在无瘢痕愈合过程中的作用。方法:建立胎兔背部切割伤模型,运用蛋白质组双向电泳技术筛选胎兔皮肤伤后差异表达的蛋白质,并进行质谱和数据库检索分析。结果:筛选出20个在伤后胎兔皮肤组织中特异高表达的蛋白质点,经过质谱和数据库检索分析后确定:伴侣素或线粒体蛋白P1前体、弹性蛋白(Vi-mentin,Vim)、微管蛋白β多肽、核不均一核糖核蛋白H(异质性胞核核糖核蛋白H)、α-烯醇酶(α-磷酸丙酮酸水合酶)等无瘢痕愈合相关蛋白在胎兔皮肤伤后表达增加。结论:上述无瘢痕愈合相关蛋白可能通过对基因转录和翻译的调控,促进胶原蛋白等的合成和正确的折叠、装配,以及促进细胞的增殖、分化和发育等,促进胎兔皮肤创伤的修复,参与其无瘢痕愈合过程。

兔体细胞核移植的初步研究

实验以兔胎儿成纤维细胞为核供体 ,对兔体细胞核移植技术的融合、激活和发育等环节进行了初步研究。实验通过比较不同电场强度对兔 2细胞胚胎卵裂球融合以及卵母细胞激活的影响 ,证实 2 0 0和 2 60V mm的电场强度可有效地诱导 2细胞胚胎的融合和兔卵母细胞的孤雌激活。然后将 2 0 0和 2 60V mm电场强度用于体细胞核移植 ,融合率分别为 44 4%和 48 4% ,卵裂率分别为 5 8 8%和 5 3 8% ,桑椹胚 囊胚发育率分别为 5 9%和 5 5 %。但 1 1 2枚核移植胚胎移植到 5只受体后没有幼子出生。结果表明 ,实验中所建立的程序至少可以支持兔体细胞克隆胚胎的早期发育。

不同麻醉方法及羊水补充量对手术胎兔成活率的影响

目的 探讨胎兔手术麻醉的合理方法及不同羊水补充量对手术胎兔成活率的影响 .方法 采用硫喷妥钠 iv与84 6合剂 im两种麻醉方法 ,比较其麻醉效果及手术胎兔成活率 ;按胎兔羊水总量的 5 0 .0 % ,70 .0 %和 10 0 .0 %补充手术中损失的羊水 ,比较术后第 5日胎兔成活率 .结果 两种麻醉方法的麻醉效果均满意 ,手术胎兔成活率均达到 83.0 %以上 ;手术胎兔羊水损失量达到总量的 5 0 .0 %时 ,胎兔成活率下降到 6 0 .9% (0 .0 1<P<0 .0 5 ) .羊水损失量低于总量的2 5 .0 %时 ,对胎兔成活率影响不明显 .结论 两种麻醉方法均能满足胎兔手术要求 。

胎兔骨髓基质细胞修复骨缺损的实验研究

为了证实体外培养的胎兔骨髓基质细胞可以修复骨缺损 ,将培养的基质细胞吸附于明胶海绵 ,植入兔骨缺损处 ,1、 2、 4、 6、 8周作 99m Tc- MDP骨显像、X片、组织切片观察骨痂生长情况。结果显示 ,平均 4周左右实验组骨缺损得到修复 。

MgSO_4对急性胎兔宫内窘迫脑损伤NMDAr1表达影响的病理学研究

目的建立孕兔宫内窘迫模型,探讨硫酸镁(MgSO4)胎兔脑损伤后NMDAr1表达的影响。方法新西兰大白兔孕兔39只,随机分为空白对照组(n=12)、假手术组(n=9)、缺血缺氧脑病组(n=9)和MgSO4保护组(n=9),缺血缺氧组和MgSO4保护组建立孕兔开腹子宫动脉结扎胎兔宫内窘迫缺血缺氧模型,并且MgSO4保护组在建立模型前给予腹腔注射MgSO4(100 mg/kg),分别开腹取各组胎兔脑组织做病理及NMDAr1表达检测。结果与空白对照组和假手术比较,缺血缺氧脑病组和MgSO4保护组NMDAr1表达强阳性,脑组织结构层次被破坏,神经细胞变性坏死,间质出血;MgSO4保护组NMDAr1免疫反应强度低于缺血缺氧脑病组,而脑组织结构层次完整性优于缺血缺氧脑病组。结论 MgSO4在一定程度上能减轻NMDAr1导致的胎儿宫内窘迫缺血缺氧病理性脑损伤,对NMDA脑损伤具有一定的保护作用。

兔胚胎-胎仔发育毒性试验中环磷酰胺给药方式的探讨

目的探讨环磷酰胺不同给药途径、给药剂量对妊娠家兔胚胎及胎仔的影响,以确定诱导胎兔畸形最佳的给药方式。方法孕兔分为生理盐水对照C组、静脉注射Y1组(15 mg/kg)、皮下注射低剂量Y2组(20 mg/kg)和皮下注射高剂量Y3组(30 mg/kg),各组均在GD10~13(受孕当天为GD0)分别按相应途径给药。GD28解剖,检查黄体数、着床数、连胎子宫重、吸收胎率;取胎仔,检查胎仔性别、身长、尾长、活胎数、死胎数,并按要求进行外观畸形、内脏畸形和骨骼畸形的检查。结果环磷酰胺静脉注射组及皮下注射低剂量组孕兔胎仔均出现了畸形,两组外观畸形率分别为30.77%和95.65%,骨骼畸形率分别为7.69%和73.91%,内脏畸形率分别为20.51%和47.83%。皮下注射高剂量组吸收胎发生率为100%。结论孕兔在GD10~13皮下注射环磷酰胺20 mg/kg可用作家兔胚胎-胎仔毒性发育试验的阳性给药方法。该方法给药周期短,操作方便,吸收胎少,胎仔畸形率高,可为同行选择合适的兔胚胎-胎仔发育毒性阳性模型提供依据。

胎儿期胎粪性腹膜炎病理学实验研究

用妊娠24日母兔的胎仔,施行宫内手术,制作胎粪性腹膜炎模型,用以研究胎仔期胎粪性腹膜炎的病理演变规律。结果发现:胎粪进入腹腔后,先以纤维素性渗出为主,术后第3日即可形成纤维性粘连,并出现钙化斑;^(45)Ca放射自显影证明,胎粪进入腹腔后,体内^(45)Ca重新分布,在腹腔病变区密集;模型胎仔总体发育落后,肠管细、粘膜层薄更为突出;用X线衍射及红外光谱分析,钙化斑的成分以结晶体羟磷灰石为主。本实验对胎粪性腹膜炎在胎儿期的形成和演变规律的发现有重要的理论意义和指导临床工作的价值,也为我国开展胎儿外科技术打下基础。

胚兔牙囊发育生物行为的组织形态学观察

研究胚兔的牙囊发育生物行为与人的牙囊发育是否相似 ,为人口腔疾病的研究提供模拟实验动物模型 ,采用光镜、电镜及激光扫描共聚焦显微镜对 4 3只胚兔的牙囊发育过程进行形态学观察。结果显示 ,牙囊来源于外胚间质 ,通过胚胎诱导形成牙支持组织 ,分化产生成牙骨质细胞、成骨细胞、成纤维细胞 ,形成牙骨质、固有牙槽骨、牙周韧带及其基质 ,对牙齿发育阶段具有保护和稳定作用 ,调控未来形成的牙周结构 ,在早期发育阶段首先出现 ,与人牙囊发育基本相似 ;最终牙囊在牙冠的顶部形成索引带 ,诱导继承牙萌出 ,在牙冠的根部形成牙支持组织 ,一部分牙囊细胞有程序性细胞死亡 。

兔自体血清与胎牛血清培养兔角膜缘细胞的比较性研究

目的:探讨自体血清与来源于同一个体的组织培养之间的关系及比较兔自体血清与胎牛血清培养兔角膜缘细胞的不同。方法:采用组织块培养法,分别采用兔自体血清及胎牛血清培养兔角膜缘细胞。结果:兔血清培养72h,细胞从组织边缘游出,第8天,膜布满整个孔底,第10天细胞呈空泡样,第14天,膜化解;胎牛血清培养48小时,细胞从组织边缘游出,第8天,膜布满整个孔底,第11天细胞呈空泡样,第16天,膜化解。结论:从形态学上观察,兔自体血清和胎牛血清培养的兔角膜缘细胞无明显差别,兔自体血清可用于兔角膜缘细胞的培养。

Cyclosporine玻璃体腔内注射对异种视网膜色素上皮移植的排异抑制作用

目的 观察兔眼视网膜下腔植入人胚眼视网膜色素上皮 (retinal pigm ent epithe-lium,RPE)后不同时期的眼底和组织学改变。研究环胞菌素 A (Cyclosporines,Cs A )玻璃体腔内注射能否抑制人胚眼 RPE在兔眼视网膜下腔中诱导的异种移植排异反应。方法 人胚眼色素上皮片和浓缩色素上皮细胞悬液植入 36只兔眼的视网膜下腔 ,其中 16眼为对照组 ,用于观察排异的自然转规。分别于 7d(8眼 )和 30 d(8眼 )后获取组织标本。另 2 0眼为实验组。RPE移植后 ,每周一次玻璃体腔内注射 Cs A1mg(12眼 )或 Cs A0 .1mg(8眼 )。视网膜和视神经的毒性反应使用 ERG进行检查。结果 人胚眼 RPE片和浓缩的 RPE细胞均能在视网膜下腔短期存活。移植的 RPE与视细胞结合良好并显示吞噬功能。排异反应发生时间约在术后 10～ 30 d。对照组中 7d的排异发生率为 0 /8;30 d排异发生率为 7/8。排异发生后荧光造影中移植区为高荧光区 ,组织切片中显示有大量的组织细胞积聚。 Cs A1mg组 30 d排异发生率为 0 /12 ,0 .1mg组为 5 /8。ERG波幅的下降与 Cs A剂量和注射次数呈正相关。结论 异种 RPE视网膜下腔移植在无免疫抑制剂的条件下 ,只能短期存活。Cs A玻璃体腔中注射能抑制异种 RPE移植的排异反应但易引起明显的视网膜毒性反应。

fat-1基因密码子优化及在家兔胎儿成纤维细胞中的初步表达

根据家兔基因密码子使用偏好性,对引自GenBank的秀丽隐杆线虫fat-1基因编码序列进行密码子优化,通过全基因合成的方法获得优化后的fat-1基因（命名为opfat-1）;从秀丽隐杆线虫中RT-PCR扩增获得fat-1。将扩增的fat-1和合成的opfat-1基因分别构建到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中。采用脂质体Lipo-fectamineTM转染法将fat-1和opfat-1基因转入家兔胎儿成纤维细胞（Rabbit fetal fibroblast cells,rFFCs）中。对比不同DNA和转染试剂用量以及细胞暴露于DNA、转染试剂中作用时间探讨影响rFFCs转染效率的参数,经过优化,最优的rFFCs转染条件为：LipofectamineTM用量2~3μl,DNA量0.8~1.0μg,LipofectamineTM与DNA、细胞共培养时间为8 h。通过绿色荧光标记和RT-PCR检测转染细胞中融合蛋白和目的基因的表达。密码子优化的opfat-1与fat-1相比,体外瞬时表达效率有极为显著的提高;G418抗性筛选获得转基因单克隆细胞,RT-PCR初步验证fat-1和opfat-1基因均在家兔胎儿成纤维细胞中稳定转录表达。

昆明山海棠提取物对新西兰兔的胚胎-胎仔发育毒性研究

目的:研究昆明山海棠提取物对妊娠动物、胚胎及胎仔发育的影响。方法:取交配成功的新西兰雌兔,按体质量随机区组法分为溶剂对照组、阳性对照组(环磷酰胺,20 mg/kg)和昆明山海棠提取物高、中、低剂量组(15.0、7.50、3.75 g/kg,以生药量计),每组均至少18只。溶剂对照组和昆明山海棠提取物各剂量组雌兔在妊娠第6~18天灌胃水或相应昆明山海棠提取物药液,5 mL/kg,每天1次;阳性对照组雌兔在妊娠第10~13天于颈部皮下注射环磷酰胺,1 mL/kg,每天1次。依据《药物生殖毒性研究技术指导原则》相关要求,在实验期间观察并记录雌兔的一般情况、体质量和摄食量,并于妊娠第28天时对其实施安乐死,解剖后观察并记录其主要脏器、带胎子宫、胎盘子宫、胎盘、卵巢以及着床腺、吸收胎、死胎、活胎、黄体等相关指标,并对胎仔进行体质量、外观形态、内脏和骨骼发育等相关指标的检查。结果:与溶剂对照组比较,昆明山海棠提取物各剂量组孕兔的体质量、体质量增长、摄食量、主要脏器,孕兔妊娠、生殖功能以及胚胎形成和胎仔的生长发育、外观形态、内脏和骨骼发育等相关指标均未见明显异常改变(P>0.05);阳性对照组上述指标均有显著变化(P<0.05),表现出明显的孕兔母体毒性以及胚胎和胎仔发育毒性。结论:昆明山海棠提取物在剂量为3.75~15.00 g/kg(以生药量计)时对新西兰兔无明显母体毒性、胚胎或胎仔发育毒性。

EGF和TRH对不同时间胎肺SP-B基因表达的影响

目的探讨表皮生长因子(EGF)和促甲状腺激素释放激素(TRH)对胎肺SP-B基因表达的影响,并与地塞米松(Dex)进行比较。方法采用兔作动物模型,产前分别给予EGF、TRH及Dex处理,通过RT-PCR及Southern印迹分析检测第25天和27天胎肺的SP-B mRNA,电镜观察胎肺板层体的形成。结果EGF、TRH和Dex处理组胎肺SP-B mRNA水平明显高于对照组,各处理组之间无显著差别,但在第25天SP-B mRNA表达仅见于Dex处理组。超微结构显示TRH、EGF和Dex处理组第27天的胎肺不仅含有板层体的Ⅱ型上皮细胞的数量显著多于对照组,而且单个Ⅱ型上皮细胞内的板层体数目也多于对照组。妊娠第25天,除Dex处理组可观察到个别Ⅱ型上皮细胞含有少量不成熟板层体外,其余处理组和对照组内均未发现。结论在妊娠第27天,EGF和TRH均能促进兔胎肺SP-B表达,其作用程度与Dex接近,但在妊娠更早时间,EGF和TRH对SP-B的促进作用不如Dex显著。胎肺SP-B mRNA可检出和升高时间与板层体出现和增加时间一致,SP-B mRNA可能是胎肺成熟的标志。

家兔供体细胞的发育周期与重构胚发育的关系

采用血清饥饿法处理体外培养的兔子胎儿成纤维细胞,并将其作为供体细胞移入去核卵母细胞内构建重构胚胎。检查供体细胞的细胞周期对重构胚的融合率、分裂率和着床率的影响。实验结果表明:培养基中血清含量在0.5%的情况下,G0/G1期的细胞比例由正常培养条件下(培养液中含有10%FCS)的73.2%明显地增加到86%以上。饥饿1-3天的细胞作为供体细胞构建重构胚时,可明显提高重构胚的融合率,但是不同的饥饿时间其融合率并无显著的差异。饥饿处理可明显增加重构胚的分裂率,以饥饿处理3天为最佳。

羊水过少对胎儿生长发育影响的实验研究

作者报告利用17只兔胎仔于妊娠24～25天行子宫内胎儿外科手术,制作成尿路梗阻、羊水过少模型。通过对胎仔大体形态学观察和形态学测量,发现实验组羊水明显减少,兔胎仔大体形态也较对照胎仔瘦小,体重、肺重及肺重占体重的百分比也显著降低。提示羊水过少对胎仔发育具有明显影响,导致胎儿宫内生长迟缓和肺发育不全。