犬腺病毒纤突蛋白基因功能区的比较分析

根据GenBank中已发表的CAV纤突基因序列 ,设计合成 4对 8条引物 ,用已建立的PCR方法 ,对犬 2型腺病毒沈阳分离株第 5代强毒经蚀斑克隆驯化的第 6 0代毒弱毒 (SY_V6 0 )和犬 1型腺病毒长春犬株 (CCC_V6 )的纤突基因进行了扩增 ,PCR产物经纯化后进行基因序列测定 ,测定结果经拼接后得到一个由 16 32和 16 2 9个核苷酸组成的纤突蛋白全基因序列 ,分别编码 5 43和 5 42个氨基酸。犬 2型腺病毒 (SY_V6 0 )与犬 1型腺病毒 (CCC_V6 )的纤突基因的同源性达到 80 .48%。犬 2型腺病毒(SY_V6 0 )与犬 1型腺病毒 (CCC_V6 )纤突基因的同源性达到 80 .48% ;根据犬的腺病毒与人 2型腺病毒纤突蛋白的序列同源性比较结果 ,推测了犬腺病毒纤突蛋白的尾 (tail)、轴 (shaft,)、结 (knob)三个功能区的氨基酸序列 ,2个型之间的尾区同源性为 76 .9% ;轴区同源性为 78.5 9% ;其结区同源性为 83.2 4% ,而同型毒株之间结和尾区同源性较高 。

纤维顶球改造增强了人5型腺病毒载体对造血细胞的感染

基于人5型腺病毒(Human adenovirus type 5,HAdV⁃5)的腺病毒载体对造血细胞的基因转导效率低,将病毒fiber基因替换为HAdV⁃11p的同源基因F11p后,载体对造血细胞的感染效率增强。本研究拟在F11p纤维顶球(knob)结构域添加RGD4C多肽或HIV包膜糖蛋白(gp120)的V3结构域,观察重组HAdV⁃5对造血细胞感染效率的变化。在前期构建的pKAd5f11p153R⁃EPG腺病毒质粒基础上,结合限制性酶切和DNA组装技术,在F11p 153 aa后(knob AB loop,153位)、228位(FG loop)以及300位(IJ loop)插入RGD4C肽或者gp120的V3肽,构建了共6种重组腺病毒载体(F153RGD⁃EG、F228RGD⁃EG、F300RGD⁃EG、F153CV⁃EG、F228CV⁃EG和F300CV⁃EG),以fiber未改造的HAdV5⁃EG和改造为F11p的F11p⁃EG病毒作对照,观察了其对4种造血细胞系U937、K562、Jurkat和HL60以及人原代T细胞的感染效率。结果显示,对于U937细胞,当感染复数(MOI,vp/cell)为100时,HAdV5⁃EG感染效率最低,为2%;其次为F228CV⁃EG,感染率为45%;F300RGD⁃EG、F153CV⁃EG和F300CV⁃EG感染率为85%~90%;F153RGD⁃EG、F228RGD⁃EG高于阳性对照病毒F11p⁃EG,三者分别为99%、99%、95%。各病毒对于Jurkat细胞的感染率均较高,但HAdV5⁃EG明显低于F11p⁃EG、F153RGD⁃EG和F228RGD⁃EG,当MOI为100时分别为75%、93%、93%和96%。感染K562细胞的情况与U937细胞类似。各病毒对于HL60细胞感染效率最低,MOI为500时,F300RGD⁃EG和F300CV⁃EG的转导效率为28%和33%,是F11p⁃EG的10倍。对于人原代T细胞,F153RGD⁃EG和F228RGD⁃EG优于F11p⁃EG,当MOI为1000时,感染率分别为87%、90%和84%。研究结果表明,F11p knob插入RGD4C比单独F11p替换的HAdV⁃5对造血细胞的感染效率高,同时,本研究还发现HAdV⁃11p fiber knob的AB、FG或IJ loop可插入外源多肽,为腺病毒嗜向性改造增加了新靶点。