我国主要流行的4种血清型禽腺病毒-Ⅰ群Fiber蛋白的交叉中和研究

为确定FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11这4个血清型FAdV间存在的交叉保护是否与病毒的纤维蛋白(Fiber)有关,制备4个血清型FAdV Fiber蛋白抗血清,在细胞水平研究其对本血清型和其他3种血清型病毒感染的中和作用。针对4个血清型FAdV的Fiber基因设计引物,进行PCR扩增,构建pCold-FAdV-Fiber重组质粒,分别转入BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western Blot鉴定表达产物;表达产物纯化后免疫SPF鸡,采集抗血清,通过LMH细胞研究不同血清型Fiber蛋白血清对各血清型FAdV感染的中和作用。PCR扩增结果显示,FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11 Fiber基因产物大小分别为1440,1575,1566,1719 bp;重组菌在16℃培养条件下,1.0 mmol/L的IPTG诱导24 h可溶性重组蛋白的表达量最高;SDS-PAGE和Western Blot结果显示,FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11表达的蛋白分子量大小分别为102,107,107,112 ku;中和结果显示,FAdV-4、FAdV-8b和FAdV-11 Fiber蛋白抗血清能中和自身血清型FAdV对细胞的感染,不能中和其他血清型FAdV的感染,而FAdV-8a Fiber蛋白抗血清不能中和这4种血清型中的任何一种血清型FAdV的感染。综上,Fiber蛋白与4个血清型FAdV全病毒之间存在的交叉保护无直接关系。

血清11型禽腺病毒Fiber蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得血清11型禽腺病毒(fowl adenovirus serotype 11,FAdV-11)纤突(Fiber)蛋白的多克隆抗体,并研究其对不同血清型FAdV Fiber蛋白的交叉反应特性,本研究利用同源重组技术将FAdV-11Fiber蛋白的编码基因克隆至原核表达载体pET-32a上,转化至BL21(DE3)感受态细胞,经诱导表达后,将纯化的重组蛋白作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体,并通过Western blot和IFA鉴定该多克隆抗体与不同血清型FAdV Fiber蛋白的交叉反应性。结果表明,His-FAdV-11-Fiber重组蛋白主要以包涵体形式表达且表达良好,Western blot和IFA结果均显示,制备的多克隆抗体能与FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11的Fiber蛋白反应,而不能与FAdV-4的2个Fiber(Fiber 1和Fiber 2)蛋白反应。综上所述,本研究成功制备兔抗FAdV-11Fiber的多克隆抗体,并验证其能特异性识别FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11的Fiber蛋白,为进一步建立FAdV-11的血清学鉴别诊断方法奠定了基础。

禽腺病毒4型Penton和Fiber1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

为开展禽腺病毒4型(FAdV-4)五邻体蛋白(Penton)和纤丝蛋白(Fiber1)多克隆抗体的制备及评价,研究通过对Penton和Fiber1基因优势抗原表位基因片段进行生物信息学分析,设计特异性引物PCR扩增获得Penton和Fiber1优势抗原表位基因片段,将其克隆至原核表达载体pColdⅠ,转入表达宿主菌BL21(DE3)进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,将纯化、鉴定后的目的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,对抗体进行Western blot鉴定及间接ELISA抗体效价测定。结果可见,FAdV-4 Penton基因序列共编码525个氨基酸,Fiber1基因序列共编码432个氨基酸,其优势抗原表位点分别有7、6个区域,且均集中于N端;成功构建pColdⅠ-P和pColdⅠ-F1重组原核表达质粒,其诱导表达的重组蛋白Penton和Fiber1均与His标签单抗发生特异性反应,动物免疫获得的Penton、Fiber1多克隆抗体均能与目的蛋白反应形成特异性条带,且Penton多克隆抗体效价高于Fiber1多克隆抗体。综上,研究获得的纯化重组蛋白Penton较Fiber1蛋白表达量更高,免疫后血清抗体效价更高,更具有制备多克隆抗体的优势。

表达FAdV-8b Fiber蛋白重组FAdV-4的构建与鉴定

为了构建能够同时防控鸡肝炎-心包积液综合征(HHS)和包涵体肝炎(IBH)的新型疫苗,本研究利用禽腺病毒4型(FAdV-4)中国流行株CH/HNJZ/2015的反向遗传操作技术,将禽腺病毒8b型(FAdV-8b)中国流行株的全长Fiber基因插入至FAdV-4基因组中1 966 bp自然缺失区,构建感染性克隆并拯救出重组病毒rHNJZ-Fiber/FAdV8b,利用PCR、Western blot和间接免疫荧光试验对重组病毒rHNJZ-Fiber/FAdV8b进行鉴定。结果表明,FAdV-8b的Fiber基因得以准确插入,Fiber蛋白正确并稳定表达,重组病毒rHNJZ-Fiber/FAdV8b具有良好的遗传稳定性,在细胞中具有与亲本毒株相似的高滴度生长特性和复制动态。本研究构建的表达FAdV-8b中国流行株Fiber基因的重组FAdV-4将为同时研发HHS和IBH的有效疫苗提供新的思路。

表达禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白的重组耐热新城疫病毒的构建及免疫效果评估

【目的】研究针对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)的耐热基因工程疫苗。【方法】利用反向遗传学操作技术将NDV耐热株的HN基因替换到LaSota疫苗株上,再将禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)的Fiber2基因插入到其基因组上,构建表达Fiber2蛋白的重组耐热NDV质粒pTS-HN-Fiber2。通过病毒拯救技术拯救重组NDV rTS-HN-Fiber2,并测定其生物学特性和作为疫苗候选株的免疫原性和攻毒保护性。【结果】rTS-HN-Fiber2的鸡胚平均致死时间>168 h,且脑内接种致病指数为0,属于弱毒的范畴;在细胞上的生长曲线结果表明,rTS-HN-Fiber2与亲本LaSota株有相似的生长曲线,但最终的生长滴度略低于LaSota株;rTS-HN-Fiber2在56℃处理15 min后,病毒滴度下降约10^(3) TCID_(50)/mL,而LaSota株56℃处理5 min几乎无感染性;间接免疫荧光试验结果表明,rTS-HN-Fiber2能表达Fiber2蛋白。免疫和攻毒试验结果显示,rTS-HN-Fiber2能产生NDV抗体,且能显著提高雏鸡在FAdV-4强毒下的存活率,减轻FAdV-4强毒引起的组织病变,降低组织中的病毒载量。【结论】本研究成功构建了表达FAdV-4 Fiber2蛋白的重组耐热NDV,该病毒保持了亲本LaSota株的弱毒生物学特性,但热稳定性有显著提升;重组NDV免疫雏鸡可产生针对NDV和FAdV-4强毒的保护,该重组NDV可作为开发针对FAdV-4和NDV二联基因工程疫苗的候选病毒株。

禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

旨在制备禽腺病毒血清4型(FAdV-4)纤突蛋白(Fiber2)的特异性单克隆抗体(MAb),本研究将原核表达的可溶性重组蛋白NusA-Fiber2作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得3株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白MAb的杂交瘤细胞株2G5、2G8、4C2,取细胞株2G5制备腹水并纯化,利用间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot鉴定该单抗的特异性。用制备的单抗包被酶标板,通过一系列的优化,建立了FAdV-4 Fiber2双抗夹心ELISA检测方法。通过逐步截短分析鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明:成功获取3株单克隆细胞株2G5、2G8、4C2。MAb 2G5可与原核表达纯化的Fiber2蛋白及FAdV-4特异性反应。建立的双抗夹心ELISA检测方法具有很好的特异性、灵敏性和重复性。该MAb识别的表位序列是N端aa1—33。本研究成功制备了具有良好Western blot和IFA反应原性的单克隆抗体,为Fiber2蛋白功能研究和FAdV-4新型表位疫苗商品化研发奠定了基础。

一株禽腺病毒4型Fiber2蛋白单克隆抗体的制备

制备禽腺病毒4型(FAdV-4)Fiber2蛋白的特异性单克隆抗体,将重组蛋白FAdV-4 Fiber2纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,分离脾脏中的淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,筛选得到10株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株1B5F1、1B5G11、1B5C1、1B5D2、1B5E3、1B5F3、1B5E4、1B5G4、1B5A8、1B5G8,取分泌抗体水平最高的1B5F1细胞株制备腹水,利用斑点杂交(Dot blot)和间接免疫荧光试验(IFA)进行特异性检测。结果表明,成功制备10株杂交瘤细胞株;制备的腹水能与FAdV-4 Fiber2蛋白及FAdV-4攻毒后的鸡肝组织产生特异性反应,证明成功制备了FAdV-4 Fiber2蛋白特异性单克隆抗体。

禽腺病毒血清4型中国流行株fiber2蛋白单克隆抗体制备与鉴定

旨在制备禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)中国流行株的fiber2蛋白的特异性单克隆抗体。以纯化的FAdV-4中国流行株CH/HNJZ/2015免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏与SP2/0细胞融合,采用基于fiber2蛋白的间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,经过5次亚克隆,获得2株分泌抗fiber2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2C3和7B4。以制备的2C3和7B4腹水进行亚型鉴定、反应原性、特异性以及中和活性测定。结果显示,成功制备了抗FAdV-4 fiber2蛋白的特异性单克隆抗体,获得的单克隆抗体均为IgM亚型,可特异性识别FAdV-4及其fiber2蛋白,为FAdV-4的免疫检测和fiber2蛋白功能研究提供了研究材料。

禽腺病毒4型湖北株的分离鉴定及其Fiber2蛋白在乳酸菌中的表达

为研究湖北地区禽腺病毒4型遗传进化情况及其Fiber2蛋白在乳酸菌中的表达情况,将采集于湖北省某养鸡场的病变组织样处理后接种至LMH细胞,分离出2株禽腺病毒,通过PCR鉴定和Hexon基因测序分析表明为禽腺病毒4型,并命名为HBJZ2021A和HBJZ2021B,遗传进化树分析结果表明,其与国内山东、浙江和北京等地区的毒株亲缘关系较近,处于同一进化分支。以其基因组DNA为模板扩增Fiber2基因并克隆至乳酸菌表达载体pNZ8148,通过酶切和测序表明成功构建了重组表达载体pNZ8148-Fiber2,并通过电转转化至NZ 9000乳酸菌,采用不同浓度梯度的Nisin进行诱导表达,SDS-PAGE及Western-Blot分析结果显示,成功在上清中表达了Fiber2蛋白。该研究结果为湖北地区禽腺病毒4型的流行情况及其口服疫苗的开发提供了参考依据。

减蛋综合征病毒抗体胶体金免疫层析试纸条的研制及初步应用

为建立快速检测减蛋综合征病毒(EDSV)抗体的方法,基于EDSV的Fiber蛋白,制备快速检测EDSV抗体的免疫层析试纸条,为养禽业提供针对病原微生物的感染预警及免疫评估。利用胶体金标记EDSV Fiber蛋白抗原为探针,将羊抗鸡IgG和抗Fiber蛋白的抗体包被到硝酸纤维膜上,分别作为质控线和检测线,对家禽EDSV抗体水平进行监测。结果表明,制备的EDSV免疫层析试纸条具有高度特异性,与其他家禽病毒抗体无交叉反应,仅与EDSV抗体反应,在试纸条上产生可见的检测线;并且制备的试纸条具有高度稳定性,在室温条件下可至少保存6个月。应用制备的检测EDSV抗体的免疫层析试纸条对从河南、安徽、山东等地养鸡场采集的576份鸡血清样本检测,与血凝抑制试验(HI)结果进行平行比较,二者的Kappa值为0.878,具有良好一致性。综上,制备的检测ESDV抗体的免疫层析试纸条具有高度的特异性、敏感性、稳定性和易操作性,对EDSV抗体的临床检测具有实际应用价值。

基于FAdV-4中国流行株Fiber2蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

利用在大肠杆菌中表达的FAdV-4中国流行株Fiber2蛋白作为包被抗原，建立了检测抗禽腺病毒血清4型（FAdV-4）中国流行株抗体的间接ELISA方法。所建立方法的最佳条件为：抗原最适包被量为0．25μg／μL，包被时间为37℃1h，然后4℃过夜；被检血清的最佳稀释度为1：800，作用时间为2h；二抗选用HRP标记的兔抗鸡IgY，稀释度为1：4000，作用时间为1．5h；显色液TMB作用条件为室温5min。所建立ELISA的判定标准为：样品的S／P值大于或等于0．0553判为阳性，小于0．0418判为阴性。用建立的ELISA方法对抗鸡新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒阳性血清进行了检测，均无交叉反应，表明该方法有较好的特异性，组内和组间重复的最大变异系数为5．6％和5．7％，所建立的ELISA方法重复性良好。用所建立的ELISA方法对50份来自于疑似患肝炎-心包积液综合征病鸡的血清样品进行检测，阳性捡出率为98％，与FAdV-4病原学检测结果符合率为100%。结果表明：本试验所建立的ELISA方法可用于抗FAdV-4中国流行株抗体的检测，为肝炎-心包积液综合征病监测和流行病学调查提供了方法。

禽腺病毒4型中国流行株Fiber2蛋白的原核表达与间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立禽腺病毒4型(FAdV-4)特异性抗体检测方法,将密码子优化合成的FAdV-4中国流行株Fiber2蛋白的编码基因克隆于pET-32a(+)载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。用纯化的Fiber2蛋白作为包被抗原,通过一系列条件的优化,建立了一种检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法。结果:该方法可以特异地检测抗FAdV-4抗体,与新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒、H5和H9亚型禽流感病毒等常见禽病毒的抗血清均无交叉反应,表明所建立ELISA具有较好的特异性;FAdV-4阳性血清经1?3 200稀释后检测结果仍为阳性,表明所建立ELISA方法具有较高的敏感性;所建立ELISA的批内和批间重复试验的变异系数分别为1.5%~5.2%和1.1%~5.6%,表明其重复性良好。应用建立的ELISA方法对河南省及周边部分地区养禽场内FAdV-4的感染情况进行了血清流行病学调查,结果显示被检地区养禽场均存在不同程度的FAdV-4型抗体阳性,平均阳性率为59.53%。由此表明本研究所建立的ELISA方法可以用于FAdV-4感染的监测和流行病学调查。

表达禽腺病毒4型中国流行株Fiber2蛋白重组新城疫病毒的构建与鉴定

利用NDV LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统,将禽腺病毒4型(FAdV-4)中国流行株的全长Fiber2基因插入到NDV基因组的P和M基因之间,构建并拯救出重组病毒rLaSota-Fiber2。利用RT-PCR和序列测定,以及Western blot对重组病毒进行了鉴定。结果显示,Fiber2基因插入位置和方向正确,Fiber2蛋白得到正确表达,表达形式为可溶的游离形式而非嵌入到NDV颗粒中。第10代重组病毒的鸡胚致病性试验和在鸡胚中的生长特性研究结果显示,重组病毒的半数鸡胚感染量(EID50)最高可达108.5/100μL,鸡胚平均致死时间(MDT)为120 h, 1日龄雏鸡脑内接种指数(ICPI)和6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)均为0,重组病毒保持了LaSota弱毒疫苗亲本毒株的低致病特性和对鸡胚良好的高滴度生长适应性。重组病毒与亲本LaSota株生长滴度在相近时间达到峰值,生长动力学特性与亲本株无明显差异。本试验构建的表达FAdV-4中国流行株Fiber2基因的重组病毒rLaSota-Fiber2有望为同时防控NDV和FAdV-4的感染提供安全、廉价和高效的辅助工具。

人55型腺病毒Fiber Knob蛋白原核表达、纯化及活性检测

[目的]构建Fiber Knob原核表达载体,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导其表达,纯化具有良好生物活性的Fiber Knob重组蛋白。[方法]从人55型腺病毒(HAdV-55)中通过PCR扩增目的基因片段Fiber Knob,将该片段与原核表达载体pET15b-His连接,构建重组原核表达质粒pET15b-Fiber Knob-His,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达目的蛋白,通过镍柱亲和层析对目的蛋白进行纯化,SDS-PAGE和Western Blotting检测目的蛋白的表达与纯度。ELISA检测目的蛋白的生物学活性。[结果]重组表达质粒经双酶切和测序鉴定证明构建正确。重组蛋白主要以包涵体形式存在,上清中也有少量表达,重组蛋白相对分子质量约为25 kDa且纯度95%以上,ELISA结果显示制备的Fiber Knob蛋白与CD46胞外域蛋白之间存在直接的相互作用,并且这种相互作用是剂量依赖性的。[结论]成功构建了原核表达质粒pET15b-Fiber Knob-His,在大肠杆菌中成功诱导表达了Fiber Knob蛋白,纯化的Fiber Knob蛋白具有明显结合CD46胞外域蛋白的生物学活性,为其单克隆抗体的制备及人55型腺病毒新的细胞受体的发现奠定了基础。

新型鸭腺病毒4型Fiber2蛋白的表达

Fiber2是鸭腺病毒4型(DAdV-4)的主要结构蛋白和免疫原性蛋白。本研究以DAdV-4毒株DNA为模板进行PCR扩增Fiber2基因片段,转化DH5a,通过EcoRI和HindII酶切后与pET28α载体通过T4DNA连接酶进行连接,构建重组表达载体,经序列测序鉴定后转化BL21(DE3)构建重组表达菌,利用IPTG诱导表达Fiber2重组蛋白,经用SDS-PAGE电泳检测,结果显示,Fiber2重组蛋白能在大肠杆菌以包涵体形式表达。上述研究为鸭腺病毒4型的防控提供物质基础。

犬2型腺病毒纤突蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

犬2型腺病毒(canine adenovirus-2,CAV-2)主要引起犬科动物的传染性呼吸道疾病和消化道疾病,且其传染性极强,全球范围内感染率非常高,但现有的临床防治措施难以完全阻断病毒的传播和快速特异性治疗患病动物。为了获得可用于CAV-2基础病毒学研究和临床诊治所需的单克隆抗体,本研究将浓缩纯化的CAV-HN45株灭活后免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经免疫过氧化物酶单层细胞试验和间接免疫荧光试验筛选出2株能分泌CAV FIBER蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞系:1-A12-C6、8-A12-B10,抗体亚类分别为IgG2a和IgG2b。腹水纯化后质量浓度为1 g/L抗体的间接免疫荧光效价为1-A12-C6:1∶8192;8-A12-B10:1∶2048,2株单克隆抗体均不能用于免疫印记试验检测。抗体具有体外中和病毒的活性,1-A12-C6和8-A12-B10抗体的CAV中和效价分别为1∶256和1∶64。本研究单克隆抗体的成功制备为建立快速、高效的CAV-2免疫学检测技术和CAV-2的防治提供了依据。

三种禽病毒抗原的串联表达、纯化及活性鉴定

为实现多个基因在同一菌株中均一可溶性表达,简化基因工程亚单位多联多价疫苗中抗原生产的工艺步骤,本研究选用Ⅰ群4型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-2蛋白、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白和减蛋综合征病毒(EDSV)Fiber蛋白3种来自不同禽病毒的抗原为研究对象,利用原核表达系统,通过密码子优化、载体启动子改造和基因串联顺序优化,获得单一载体/多重转录单元的共表达重组质粒。将共表达重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,进行3个基因的共表达。纯化后的蛋白进行Western blotting和蛋白活性检测。结果表明,目的基因经过密码子优化、载体启动子改造和基因串联顺序的优化后,获得均一可溶性共表达的3种蛋白,纯化后蛋白纯度大于80%,Western blotting分析和琼脂扩散试验表明串联表达的3种蛋白具有免疫反应性和抗原活性。文中通过目的基因密码子优化、表达载体启动子改造和基因串联等关键技术的突破,首次实现了3种不同禽病毒抗原的高效、均一、可溶性串联表达和纯化,为基因工程亚单位多联多价疫苗的研制奠定了基础。