安卡拉病毒贵州分离株Fiber2基因的克隆及序列分析

Fiber2蛋白是禽腺病毒血清4型(FAdV-4,又称安卡拉病毒)重要的免疫原蛋白,为深入了解FAdV-4贵州株Fiber2基因的遗传变异情况,本研究利用PCR技术扩增FAdV-4贵州晴隆株(GZ-QL)Fiber2基因,胶回收后将其连接至pMD19-T载体,转化入DH5α筛选阳性克隆质粒,经质粒PCR及双酶切鉴定后进行DNA测序,然后对测序结果进行生物信息学分析。结果显示,GZ-QL株Fiber2基因全长为1 440 bp,与四川分离的SCnj1601强毒株、北京分离的NIVD2强毒株Fiber2基因核苷酸同源性均为100.0%,与FAdV-4经典ON1株Fiber2基因核苷酸同源性为95.9%,两者位于相同进化分支。GZ-QL Fiber2蛋白共有33个氨基酸突变位点,其中,在第11~15位之间有5个氨基酸插入;蛋白质亲水性平均值为-0.031,其二级结构以无规则卷曲为主(占51.8%),无跨膜结构域或信号肽,抗原表位分布均匀,预测有8个优势抗原表位区域,且集中于N端。以上结果表明,FAdV-4贵州株GZ-QL Fiber2蛋白在禽腺病毒血清4型内相对保守且抗原性良好,具备成为优势抗原的潜力。

鸭腺病毒3型LAMP快速检测方法的建立

鸭腺病毒3型(DAdV-3)是我国鸭群中出现的一种新型腺病毒,属于腺病毒科禽腺病毒属成员。为建立DAdV-3的快速检测方法,本研究根据DAdV-3的fiber2基因,设计特异性的LAMP检测引物,构建重组质粒标准品pT-DAdV-3,经各反应条件优化,建立了DAdV-3 LAMP快速检测方法。结果显示,建立的LAMP检测方法最佳反应条件为64℃40 min;该方法仅对DAdV-3呈阳性反应,与番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源减蛋综合征病毒等其他常见鸭源传染病病原均无交叉反应,特异性强。该方法对重组质粒标准品的最低检测限为50拷贝/μL;利用本研究建立的LAMP方法、前期建立的PCR方法和基于MGB探针的荧光定量PCR方法对临床收集的66份鸭组织病料样品进行检测,结果显示阳性率分别为13.63%(9/66)、13.63%(9/66)和15.15%(10/66);且LAMP检测的阳性样品经PCR方法检测和荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究首次建立了检测DAdV-3的LAMP方法,该方法快速敏感、特异性强,为该病的流行病学调查提供技术支撑。

2株鸡源血清4型禽腺病毒的分离鉴定及致病性研究

为了解江苏东台地区4型禽腺病毒(FAdV-4)分离株的遗传进化情况及其致病性。本研究收集13份疑似患有心包积水-肝炎综合征病鸡的心脏、肝脏和脾脏等组织进行PCR鉴定,阳性样品分别接种鸡肝癌细胞系(LMH)进行病毒分离,对纯化后鉴定的FAdV-4 Hexon基因和Fiber2基因进行序列分析,并将FAdV-4肌肉接种SPF鸡进行动物回归实验。结果显示,13份样品中有9份PCR扩增出500 bp的FAdV Hexon基因条带;其中2份样品在接种细胞48 h^60 h后可见细胞变圆皱缩,形成典型的细胞病变并能稳定传代。Hexon基因同源性和遗传进化分析显示,2株分离株的同源性为99.9%,与SDNY1-15和PDS株的亲缘关系最近,且同源性分别为99.9%和100%;Fiber2全长基因的Alu酶谱分析显示2株病毒没有差异,均为致病性FAdV-4,将病毒分别命名为FAdV-4 DT和FAdV-4 AN。动物回归实验结果显示,DT和AN株对4周龄SPF鸡的致死率分别为50%和90%,剖检可见典型的心包积液,肝脏肿大出血;病理组织学观察可见,两株分离病毒均能致SPF鸡心肌水肿并伴有淋巴细胞浸润,肝脂肪变性、坏死、出血,肝细胞核内可见嗜碱性包涵体等特征性病变,与FAdV-4感染的病变一致;AN株感染后脏器病变比DT株严重。本研究对2株鸡源FAdV-4的鉴定为进一步探究其致病机理提供了实验基础。

禽腺病毒DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

禽腺病毒属成员鸭腺病毒3型(duck adenovirus type 3,DAdV-3)和禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype-4,FAdV-4)是养殖场主要流行的病原,对养禽业造成巨大的经济损失。目前尚未见可同时快速检测这2种病原的双重荧光定量PCR检测方法,本研究基于DAdV-3 GDMM10毒株和FAdV-4 GDMZ毒株Fiber2基因序列比对及遗传进化分析,分别在Fiber2基因保守区设计特异性引物,建立了能同时鉴别临床上常见的DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR检测方法。结果表明,DAdV-3 GDMM10和FAdV-4 GDMZ Fiber2基因处于两个不同进化分支上,同源性为46.10%。建立的检测DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,最低可检出45拷贝/μL的DAdV-3样品和17拷贝/μL的FAdV-4样品;且检测结果可直接通过Tm值差异进行判定,简化操作时间。利用该双重荧光定量PCR方法对2022年度临床上采集的34份肝炎-心包积液疑似样品进行检测,DAdV-3和FAdV-4检出率分别为17.65%和2.94%。为进一步开展禽源DAdV-3和FAdV-4的分子流行病学及共感染致病机制奠定了基础。