百日咳杆菌LPF和FHA的纯化及其特性的研究

采用羟基磷灰石、HP—Sepharose 4B和Sephadex G—200色层分析方法,精制出了单一的白细胞增多促进因子(LPF)和丝状血凝素(FHA)组分.经SDS—PAGE证明,精制LPF呈现四条带,其分子量分别为30,000、27,000、23,000和14,000;精制FHA呈现三条带,其分子量分别为185,000、130,000、105,000.ELISA检测证明,精制LPF为620EU/mL,精制FHA为402EU/mL;小鼠LP和HS活性测定结果证明,0.136μg的精制LPF可引起白细胞的明显增高,0.015μg可引起HS活性,0.29μg可引起组胺致敏小鼠50%的死亡;CHO细胞簇聚活性检测结果显示,3.3pg的精制LPF可引起CHO细胞明显的簇聚反应;免疫双扩散试验结果显示,精制LPF和FHA分别与其相应的抗LPF和抗FHA血清形成特异性的沉淀线;电镜结果显示,精制LPF呈直径约6nm的球形颗粒;精制FHA呈2×40—100nm的丝状结构.

无细胞百日咳菌苗纯度和生物学特性研究

本文对无细胞百日咳菌苗的纯度、免疫力和毒性进行了研究。实验证明菌苗中不仅含有百日咳毒素 (PT)和丝状血凝素 (FHA) ,而且还含有百日咳凝集素和百日咳粘着素。菌苗的纯度为 5 0 %～ 95 7% ,菌苗中PT和FHA的比例为 1∶1～ 1∶18。

无细胞百日咳菌苗的简易制备方法及其检定

报道一种简易制备无细胞百日咳菌苗(APV)的方法。SDS—PAGE证实抗原纯度高;免疫小鼠血清ELISA滴度高。此外,小鼠毒性、家兔热原及效力试验显示制得菌苗均符合规程要求。本方法是一种可行的候选方法。

溶液环境对百日咳疫苗分离纯化的影响

针对百日咳疫苗在低盐条件下不稳定,容易聚集而导致层析过程收率低、分离度低的难题,实验中选择脲作为稳定剂来改善百日咳疫苗所处的溶液环境,并采用离子交换层析和凝胶过滤层析进行百日咳疫苗的分离纯化,通过ELISA抗原活性测定和还原性SDS-PAGE等方法研究了脲对百日咳疫苗分离纯化的影响。结果表明,在流动相中加入2mol/L脲作为稳定剂,能显著提高离子交换层析和凝胶过滤层析中的PT和FHA活性回收率、凝胶过滤层析的分离度、PT和FHA的纯度。这些结果对百日咳疫苗的分离纯化和层析工艺优化提供了重要的依据和参考。

百日咳丝状血凝素酶联免疫检测法的建立

目的建立百日咳组分疫苗丝状血凝素(FHA)抗原含量监控的ELISA检测法。方法制备的多克隆抗血清,经辛酸硫酸铵法纯化抗体,用过碘酸钠氧化法辣根过氧化物酶标记,以棋盘滴定法确定最佳包被抗体及酶标抗体的浓度配伍,建立了双抗体夹心ELISA检测法。结果对双抗体夹心ELISA法的特异性、最佳线性范围、检测限度、精密度、准确度、测定限量、适用性的一系列验证试验表明,该方法与百日咳组分疫苗中PT和Prn无明显交叉反应,特异性较好。在0至20 ng/mL测量区间有最佳线性,相关系数大于0.99;经实验内12次及不同试验间3次测定16、8、4 ng/mL中的FHA含量,变异系数在0.2%～11.4%间,回收率在96.9%～114.5%间,精密度及准确度验证均符合常规质控要求,因此测定限量为4 ng/mL。结论该方法能有效检测出百日咳杆菌培养上清中的FHA含量,可用于百日咳组分疫苗生产过程的中间品质量控制。

百日咳丝状血凝素的纯化及初步鉴定

目的从百日咳鲍特菌中提纯百日咳丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA),并对其进行初步鉴定。方法采用珍珠岩吸附层析和羟基磷灰石吸附层析相结合的方法,从百日咳鲍特菌培养上清中纯化FHA;SDSPAGE电泳和PAGE电泳分析样品纯度,并经斑点免疫印迹法对其进行鉴定。结果纯化样品的纯度达到95%以上,斑点免疫印迹中和FHA单抗有反应斑点,与百日咳毒素(pertussis toxin,PT)单抗无反应斑点。结论珍珠岩吸附层析和羟基磷灰石吸附层析相结合的方法可作为一种快速有效的纯化手段提取纯度较高的FHA,有望作为参考品用于百日咳FHA抗原含量检测、抗FHA血清抗体滴度检测及抗原纯度检测。

百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳黏附素抗体间接ELISA检测方法的建立、验证及初步应用

目的建立小鼠血清中百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)及百日咳黏附素(pertussis adhesin,PRN)抗体间接ELISA定量检测方法,并进行验证及初步应用,为百日咳疫苗生产工艺的优化提供参考。方法分别用PT、FHA及PRN抗原包被酶标板,加入百日咳抗小鼠血清标准品及待测小鼠血清,以HRP标记的山羊抗鼠IgG作为酶标二抗,通过TMB显色的指示程度定量检测小鼠血清中PT、FHA、PRN抗体含量。对建立的间接ELISA检测方法进行专属性、线性范围、准确性、精密性进行验证。采用建立的方法对百日咳疫苗及效价合格的内部参比品免疫小鼠血清进行检测。结果采用PT、FHA、PRN抗体ELISA方法检测百日咳抗小鼠血清标准品及待测样品的结果为阳性,其余样本检测结果均为阴性。PT抗体ELISA检测方法的线性范围为0.0053~0.17 U/mL,回收率为90.91%~104.77%,重复性验证RSD为6.31%,人员间RSD为6.40%;FHA抗体ELISA检测方法的线性范围为0.0223~1.43 U/mL,回收率为95.84%~102.18%,重复性验证RSD为9.02%,人员间RSD为5.79%;PRN抗体ELISA检测方法的线性范围为0.0094~0.3 U/mL,回收率为86.27%~100.22%,重复性验证RSD为6.94%,人员间RSD为8.90%。采用建立的方法检测百日咳疫苗样品及效价合格的内部参比品免疫小鼠血清,6组样品PT抗体水平明显高于内部参比品,FHA、PRN抗体水平与内部参比品相当。结论建立的各抗体ELISA检测方法专属性强,线性相关性良好(R2>0.99),准确性高,精密性良好,可用于小鼠血清中百日咳(PT、FHA、PRN)抗体的定量检测,为百日咳疫苗生产工艺的优化提供了参考。

去除百日咳毒素、丝状血凝素中内毒素的工艺探索

目的探讨无细胞百日咳疫苗纯化工艺中百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)的内毒素去除问题。方法选用Triton法和离子交换层析法,分别对百日咳杆菌发酵液上清和经Capto SP Imp Res柱纯化的发酵液进行内毒素去除,按《中国药典》三部(2015版)相关方法检测纯化样品的蛋白含量、内毒素含量、抗原含量,并进行SDS-PAGE分析。结果使用Triton法和离子交换层析法均可以将FHA和PT这两种成分的内毒素在脱毒前阶段降低至200 EU/mg以下。在合适的纯化条件下使用离子层析去除内毒素的能力高于Triton法,而在对抗原的回收率上Triton法又稍占优势。结论使用Triton法和离子交换层析法均可解决FHA和PT去除内毒素的问题,两类工艺下对目的蛋白活性的影响有待进一步研究。

百日咳丝状血凝素单克隆抗体的制备及ELISA定量检测方法的建立

目的制备百日咳丝状血凝素(Filamentous hemagglutinin,FHA)单克隆抗体,并建立双抗体夹心ELISA法用于检测FHA的含量。方法采用杂交瘤技术制备FHA单抗,并对其进行鉴定;优化ELISA系统反应条件,建立FHA双抗体夹心ELISA定量检测方法,并对其进行精密性及准确性验证;应用建立的方法检测本所12批无细胞百日咳疫苗生产中间样品中FHA的含量。结果获得4株稳定分泌抗FHA单抗的杂交瘤细胞株,抗体亚型分别为IgG1和IgG2b,抗体腹水ELISA效价达1∶105～1∶106,均能与FHA发生特异性反应,而与百日咳毒素和流感病毒血凝素未发生交叉反应;建立的双抗体夹心ELISA法的线性检测范围在1.56～100.00 ng/ml之间,板内和板间变异系数均小于10%;FHA高、中、低浓度的回收率分别为94.73%、108.67%和116.37%;12批无细胞百日咳疫苗生产中间样品中FHA的含量在X±2SD范围内比较稳定。结论已成功制备了抗FHA单抗,并建立了精密性和准确性均较好的定量检测FHA的双抗体夹心ELISA法,可用于无细胞百日咳疫苗生产中间产品中FHA的定量检测。

无细胞百日咳疫苗纯化新工艺的建立

目的建立适合大规模生产的无细胞百日咳疫苗(Acellular pertussis vaccine,APV)纯化新工艺,使疫苗主要成分的比例稳定可控。方法复苏百日咳菌种并传代培养,在大罐发酵培养收获前,调整菌液的pH值至弱酸性,再通过离心获得上清液,经超滤浓缩和脱盐处理,使用阳离子交换层析进行目的组分的分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE分离并经Western blot鉴定,确定最佳纯化条件。用建立的层析纯化新工艺连续纯化3批APV,检测各项指标,验证该工艺的重复性。结果收获前菌液pH值调至5.8～6.0,可使疫苗主要保护抗原在上清液中的含量明显提高;采用强阳离子交换层析的方法,从目的蛋白的捕获到多组分的分离提纯可一步完成,各目的蛋白组分的纯度均可达85%以上,回收率可达90%以上;建立的纯化新工艺具有良好的重复性。结论初步建立了可线性放大、适合APV大规模生产的层析纯化新工艺,为疫苗质量标准的提高奠定了基础。

去除无细胞百日咳疫苗丝状血凝素纯化液中内毒素TritonX-114液相分离法的建立及其效果评价

目的建立去除无细胞百日咳疫苗丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)纯化液中内毒素的TritonX-114液相分离法,并评价其效果。方法以影响TritonX-114液相分离法效果的TritonX-114加入量、4℃混匀时间、37℃分层时间、25℃16743×g离心时间为试验因素,每个因素设计3个水平,通过正交试验设计12组试验。每组试验获得的样品均检测蛋白回收率,以蛋白回收率最高的条件为最佳。采用最佳条件去除3批无细胞百日咳疫苗FHA纯化液内毒素,检测FHA蛋白含量、内毒素含量及TritonX-114残留量。结果TritonX-114液相分离法最佳条件:TritonX-114加入量为1%,4℃混匀时间为30 min,37℃分层时间为60 min,25℃16743×g离心时间为10 min。最佳条件下去除3批无细胞百日咳疫苗FHA纯化液内毒素后,内毒素含量均<0.25 EU/mL,TritonX-114残留量均值为0.183%,蛋白回收率均值为91.04%。结论TritonX-114液相分离法能够有效去除无细胞百日咳疫苗FHA纯化液中的内毒素,且方法耗时短,操作简便。

培养条件对百日咳杆菌发酵中百日咳毒素及丝状血凝素表达的影响

目的探讨培养条件对百日咳杆菌发酵中百日咳毒素(pertussis toxin,PT)和丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)表达的影响。方法采用300 L全自动发酵罐进行百日咳杆菌发酵培养,培养基为百日咳S-S培养基,搅拌通气培养,培养量200 L,温度3537℃,培养时间40 h,接种比例1∶121∶15。试验分为高PT表达组(搅拌转速为160 r/min,搅拌叶片为直叶,有挡板,培养020及2140 h的通气量分别为600和400 L/min)、高FHA表达组(搅拌转速为220 r/min,搅拌叶片为弯叶,无挡板,培养020及2140 h的通气量分别为400和600 L/min)及对照组(搅拌转速为180 r/min,搅拌叶片为直叶,有挡板,通气量为500 L/min),每组平行培养3批培养物。于培养结束时采用ELISA法检测PT及FHA含量。结果高PT表达组PT含量平均值达3.16μg/mL,比对照组(平均值2.23μg/m L)提升了41.7%(P<0.05);高FHA表达组FHA含量平均值达21.37μg/mL,比对照组(平均值11.00μg/mL)提升了94.3%(P<0.05)。结论百日咳发酵工艺中,高搅拌剪切力和较低的溶氧水平有利于PT的表达,低剪切力和高溶氧水平有利于提高FHA的产量。

不同氢氧化铝佐剂和吸附方式对无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗免疫效果的影响

目的 研究不同氢氧化铝佐剂含量、两种吸附方式以及不同厂家氢氧化铝佐剂对无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗（DTaP-sIPV）免疫效果的影响.方法 用0.42 mg/ml、0.47 mg/ml、0.52 mg/ml终浓度的铝吸附相同剂量的百白破5种抗原,用顺序吸附和分别吸附两种方式吸附抗原,使用进口和自制氢氧化铝,比较各抗原的吸附率、各抗原抗体水平以及百日咳、破伤风、白喉疫苗效价.结果 0.52 mg/ml铝含量组吸附率最高,0.42 mg/ml铝含量组吸附率最低;顺序吸附和分别吸附两种吸附方式没有明显差异;使用进口氢氧化铝佐剂和自制氢氧化铝佐剂组分抗体反应各有不同,差异无统计学意义.结论 0.52 mg/ml铝含量、自制氢氧化铝佐剂和分别吸附的方式适用于DTaP-sIPV疫苗的制备.

百日咳丝状血凝素与志贺毒素B亚单位的融合表达及其免疫保护效果评价

目的融合表达百日咳丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)片段FHA1877-2250与志贺毒素B亚单位(Shiga toxin B subunit,StxB)蛋白,并对融合蛋白StxB-Fha1877-2250的免疫保护效果进行评价。方法设计引物将StxB片段连接至FHA1877-2250N-端,构建重组表达质粒pET-28a-FHA1877-2250和pET-28a-StxB-Fha1877-2250,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经镍柱亲和层析和复性后,通过皮下免疫小鼠,共3次,间隔2周。末次免疫后10 d,尾静脉采血,间接ELISA法检测血清抗体效价;血清体外杀菌试验检测杀菌效率;末次免疫后第14天,经腹腔接种2倍半数致死剂量(1.21×108CFU)的百日咳Bp148株菌液,评价动物攻毒保护效果。结果重组表达质粒经菌落PCR和测序证实构建正确。表达的重组蛋白FHA1877-2250、StxB-Fha1877-2250经SDS-PAGE和Western blot分析显示,相对分子质量分别约为43000和51000。StxB-Fha1877-2250免疫小鼠血清抗体效价可达1∶3200。StxB-Fha1877-2250组的血清杀菌效率比FHA1877-2250组略好。以百日咳Bp148菌株攻毒,FHA1877-2250、StxB-Fha1877-2250蛋白对免疫小鼠具有保护力,保护率分别为40%和60%。结论重组融合蛋白StxB-Fha1877-2250相比于FHA1877-2250具有更好的免疫原性和保护效果,为百日咳亚单位疫苗的研究提供了新的思路。

百日咳毒素、丝状血凝素和黏附素的纯化

目的采用新型层析介质对无细胞百日咳疫苗百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamen-toushemagglutinin,FHA)和黏附素(pertactin,PRN)3组分进行分离纯化。方法调整PT和FHA发酵液上清的pH值和电导后,PT经Capto SP ImpRes和Capto MMC进行两步层析,FHA经Capto SP ImpRes进行一步层析;PRN热处理原液经Capto Adhere和Capto SP ImpRes进行两步层析。纯化产物经4%～12%NuPAGE进行鉴定,ImageQ分析纯度;LC-MASS(Thermo LTQ Velas)进行蛋白质的质谱检测;PT和FHA经BiaCore T200进行定量分析,并计算各步回收率。结果纯化后,无细胞百日咳疫苗3组分纯度均达95%以上;PT和FHA的总回收率均在30%左右;电泳图谱上的各组分条带经LC-MASS鉴定,均与Uniprot Bordetella pertussis数据库数据高度同源。结论采用新型层析介质有效纯化了无细胞百日咳疫苗PT、FHA和PRN,提高了抗原纯度,大大缩短了生产时间。

百日咳杆菌无动物源培养基的筛选及其对百日咳毒素和丝状血凝素产量的影响

目的确定百日咳杆菌无动物源培养基最佳配方,并检测其对百日咳毒素(pertussis toxin,PT)和丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)产量的影响。方法分别按一定比例混合使用或单独使用无动物源蛋白Hy Pep5603(小米和小麦蛋白)、精选大豆胨,替代培养基中动物源性成分(酸水解酪蛋白)作为氮源,进行百日咳杆菌摇瓶培养,比较细菌生长密度和产物生产量。以最高PT和FHA产量为参考标准,确定最佳培养基配方。用该配方与动物源培养基对比,进行4批30 L百日咳杆菌发酵培养;发酵液处理后,用离子交换层析分离PT和FHA样品,ELISA法测定各样品中PT和FHA的蛋白含量,SDS-PAGE法检测产物的相对分子质量大小。结果由无动物氮源Hy Pep56034.0 g/L、精选大豆胨6.0 g/L加改良SS培养基组成的培养基,摇瓶培养百日咳杆菌后最高A550为3.8,发酵百日咳杆菌后最高A550为5.8,均能有效地供菌体生长,且优于单独使用动物源或无动物源培养基;用该配方发酵百日咳杆菌并纯化,获得PT的产量约为5.7 mg/L,FHA产量约为23.0 mg/L,均高于用动物源培养基培养后的产物,且相对分子质量大小一致。结论用含Hy Pep5603 4.0 g/L、精选大豆胨6.0 g/L的无动物源培养基培养百日咳杆菌,可替代动物源培养基,用于PT和FHA的生产。

无细胞百日咳疫苗血清学效价检测方法的建立及适用性的初步验证

目的建立无细胞百日咳疫苗血清学效价检测方法(PSPT),并对其适用性进行初步验证。方法采用纯化的百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)包被酶标板,以羊抗鼠IgG酶标抗体为指示抗体,建立检测小鼠抗PT抗体和抗FHA抗体的间接ELISA法,并对该方法进行初步验证。在此基础上建立PSPT法,并与MICA法进行相关性分析。结果建立了小鼠抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA,标准曲线线性范围内R≥0.99;经验证,两系统与无关抗体之间均无交叉反应;检测限度分别为93.7500和59.0625mEU/ml,检测限量分别为100和70mEU/ml。将10批无细胞百日咳原液分别以PSPT法和MICA法进行效价测定,两者呈正相关,两种方法检测结果差异无统计学意义,且PSPT法比MICA法重复性更好。结论抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA灵敏度高,准确性及精密性均较好,在此基础上建立起来的PSPT法有望替代MICA法,用于检测无细胞百日咳疫苗的效价。