迟钝爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统基因的克隆及多重PCR检测方法的建立

采用PCR法扩增大菱鲆Scophthalmus maximus出血性败血症病原菌迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tardaL-49231菌株Ⅲ型分泌系统(TTSS)的装置蛋白(esaC)、效应蛋白(eseB、eseC、eseD)和调节蛋白(esrA、esrB)6种基因,并将其克隆到载体PMD19-T中分别进行测序;通过优化反应条件,建立一次检出效应蛋白eseB、eseC和eseD 3种基因片段的多重PCR方法;采用所建立的多重PCR方法检测迟钝爱德华氏菌不同菌株(L-49231、GhAn080310、GhAn080313和GhAn080314)、沙门氏菌Salmonella enterica、大肠杆菌Escherichia coli和肠杆菌Enterobacter中效应蛋白基因的存在情况。结果表明:L-49231菌株中存在esaC、eseB、eseC、eseD、esrA和esrB 6种基因片段,大小分别为837、184、934、445、464、458 bp,与GenBank中迟钝爱德华氏菌PPD130/91菌株的这6种基因的同源性分别为99%、97%、99%、99%、99%、98%;通过优化反应条件,在退火温度为54℃,基因eseB、eseC和eseD引物浓度(μmol/L)组合比为5∶10∶2,Mg2+浓度为1.5 mmol/L时,能够得到清晰、稳定且均一的多重PCR产物,并与目的条带分子量一致;采用所建立的多重PCR方法进行检测,迟钝爱德华氏菌L-49231菌株中存在eseB、eseC和eseD 3种基因片段,迟钝爱德华氏菌GhAn080310、GhAn080313、GhAn080314菌株中存在eseB和eseC基因片段,但未检出eseD基因片段;沙门氏菌、大肠杆菌和肠杆菌中均未检出eseB、eseC和eseD基因。表明所建立的多重PCR方法对迟钝爱德华氏菌具有较好的特异性,可检出具有Ⅲ型分泌系统效应蛋白的菌株。

多重PCR技术在呼吸系统疾病微生物检测中的应用进展

呼吸系统疾病是一种常见病、多发病，是对健康危害较大的临床常见病症，引起呼吸系统疾病的病原微生物十分复杂，包括细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等，并且新的病原体还在不断地被发现，给疾病诊断和治疗造成极大的闲难。由于目前临床诊治呼吸系统疾病的盲目性较大，针对非细菌性呼吸系统疾病，滥用抗生素的现象十分普遍。

番茄黄化曲叶病毒的系统发育分析及多重PCR快速检测

通过对国内已报道的番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的DNA-A全基因组进行序列比对分析,发现TYLCV各中国分离物具有较高的相似性。TYLCV全序列及CP序列核苷酸和氨基酸系统发育分析结果显示,我国中东部及东南沿海地区为番茄黄化曲叶以色列病毒(TYLCV-IL)各分离物所侵染,而西部和西南部内陆地区为番茄黄化曲叶中国病毒(TYLCCNV)各分离物所侵染。基因多态性分析结果表明,TYLCV在进化上具有较强的保守性,但核苷酸突变位点(Pi)在染色体上的分布却具有较高的多态性,因此针对TYLCV的严格保守区设计出3对特异性引物,建立了以多重PCR技术为基础的快速、高效、特异性检测TYLCV的方法。

疑似中枢神经系统感染患者脑脊液病原体多重PCR检测结果的研究

目的分析脑膜炎/脑炎多重PCR(MEMP-19)检测技术检测疑似中枢神经系统(CNS)感染患者脑脊液病原体的结果。方法选取2019年10-11月于四川大学华西医院就诊的208例患者的脑脊液标本,提取核酸,使用MEMP-19技术进行检测并对结果进行分析,统计病历和临床治疗信息。结果208例脑脊液标本中,有43例检测出病原体,总检出率为20.67%。疑似CNS感染组病原体检出率为48.53%,其中EB病毒检出率最高(29.41%),新型隐球菌和结核分枝杆菌检出率分别为17.65%和10.29%。单一感染占63.64%(21/33),双重感染占30.30%(10/33),三重感染占6.06%(2/33)。非CNS感染组病原体检出率为7.14%,其中肠道病毒6例,EB病毒4例,均为单一感染。疑似CNS感染组MEMP-19阳性和阴性患者临床症状和脑脊液相关指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论MEMP-19技术可以快速、准确地对脑脊液中的多种病原体进行筛查、检测,有助于实验室及时为临床提供CNS感染的病原学依据。

Filmarray全自动医用PCR分析系统检测临床疑似呼吸道感染患者的数据分析

目的回顾性分析Filmarray全自动医用PCR分析系统对呼吸道感染的诊断潜力和临床应用。方法选取该院2016年8月至2019年6月临床疑似呼吸道感染的231例门诊、住院患者,比较Filmarray全自动医用PCR分析系统检测20种常见呼吸道相关病原体的结果,分析住院患者临床资料,评价Filmarray全自动医用PCR分析系统在临床应用中的价值。结果共检测住院患者160例,呼吸道病原体阳性率为38.13%,其中呼吸科患者检测总例数最多,占61.25%,儿科患者阳性率最高,为77.78%;共检测门诊患者71例,阳性率为36.62%,急诊科患者检测总例数最多,占32.39%。呼吸科住院患者与非呼吸科住院患者的年龄、吸烟、慢性阻塞性肺疾病、体温、咳嗽、肌肉痛或疲劳、咳痰,以及白细胞计数、B型脑钠肽水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论应用Filmarray全自动医用PCR分析系统能快速检测常见呼吸道感染相关病原体,对呼吸道感染性疾病的诊断及治疗有重要意义。

基于PrimerHunter的多重PCR引物设计系统的构建与应用

PrimerHunter是一款多重PCR引物设计软件,该软件能够高效地设计出具有特异性的多重引物,但是只能在Linux系统的命令行中运行,而且没有考虑引物二聚体的问题。针对这些问题,文章建立了基于PrimerHunter的多重PCR引物设计系统,实现了PrimerHunter的界面化,完成了C/S模式向B/S模式的转换,同时增加了原软件不具备的引物二聚体检测模块,能够有效检测引物对之间的二聚体情况,为相关生物学领域研究提供了一种高效的多重PCR引物设计工具。

特异性检测植物乳杆菌的多重PCR方法

【目的】建立特异性检测植物乳杆菌的方法,排除近缘菌的干扰。【方法】利用SMM系统筛选植物乳杆菌种特异序列,根据特异序列设计引物进行不同乳制品的多重PCR检测。【结果】设计的7对引物具有良好的种特异性,其中3对引物可以排除戊糖乳杆菌和副植物乳杆菌的干扰,可扩增获得植物乳杆菌的特异条带101bp(引物LP-1和LP-2)、189bp(引物LP-5和LP-6)、378bp(引物LP-9和LP-10)。该方法的检测限为2.2×10CFU/mL。采用多重PCR检测与琼脂糖凝胶电泳图谱分析对自制含有各种乳酸菌酸奶产品、自然发酵产品及市售酸乳产品中植物乳杆菌进行定性检测,可以特异性检测出植物乳杆菌,准确区分植物乳杆菌的近缘菌株。【结论】该多重PCR方法成本低、步骤简单、耗时短、灵敏度高,具有特异性,可作为快速检测植物乳杆菌种的方法在生产中使用。

改良多重实时荧光定量PCR检测流感A型和B型病毒

目的：建立改良多重实时荧光定量PCR体系快速检测流感A型和B型病毒。方法根据生物信息学分析结果选定流感A型和B型病毒的靶序列，建立MRT－PCR检测体系。构建质粒标准品，评估所建立体系的灵敏度、特异性和重复性。结果成功建立了基于同源加尾系统和Taqman－分子灯标探针的改良多重实时荧光定量PCR检测体系；该方法最低检测限为102 copies／μl，特异性良好，重复性良好，变异系数（CV）为0．99％～2．50％。结论建立了快速、敏感、特异、稳定地改良多重实时荧光定量PCR（ MRT－PCR）检测体系，具有良好的临床应用前景。

猪圆环病毒多重PCR诊断方法的建立

猪圆环病毒(PCV)是迄今发现的最小的动物病毒.主要引发猪断乳后多系统衰竭综合征(PMWS),该病主要特征是猪进行性消瘦、多系统病理损伤,严重影响断乳猪生长发育.对PCV和PMWS的一系列研究表明,PCV在猪体内长期演变过程中,产生了有致病性的变异株,称为PCV2;相应地将没有致病性的持续污染PK15细胞的毒株称为PCV1.PCV1是无致病性的,广泛存在于猪群中,而PCV2是致病性的,能引起多种疾病综合征.

多重基因遗传表达分析系统及其应用研究进展

核酸检测技术广泛用于生命科学、微生物学及医学领域。随着分子生物学的发展,在经典技术的基础上研究人员又开发出多种新型检测技术。其中多重基因遗传表达分析系统(gene expression profiler genetic analysis system,Ge XP)技术作为聚合酶链式反应和芯片的换代技术,具有特异性好、灵敏度高的特点,能够同时检测多个目的基因,真正意义上实现了高通量检测。本文详细介绍了Ge XP技术的原理以及优缺点,并对Ge XP技术在畜牧兽医研究、转基因食品检测、微生物检测及医学研究中的应用进行阐述,以期为该技术将来在食品检测方面的推广提供参考。

应用多重GeXP-PCR同时检测6种鸡免疫抑制病病毒的研究

拟建立一种基于GeXP多基因表达分析系统的多重PCR方法,同时检测6种鸡免疫抑制病病毒——鸡马立克病毒、禽白血病病毒(包括A、B和J亚群)、禽网状内皮组织增生症病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性贫血病毒和传染性法氏囊炎病毒。多重PCR反应使用嵌合引物和通用引物组合的反应体系,经过GeXP多基因表达分析系统进行毛细管电泳,鉴别PCR产物片段;通过调整嵌合引物浓度、Mg^(2+)浓度、Taq酶浓度优化反应体系及调整退火温度和时间优化反应条件。应用建立的多重GeXP-PCR,分别单独和同时检测6种鸡免疫抑制病病毒的8个目的基因,同时以其他常见禽类病毒和鸡组织器官核酸为对照,验证其特异性;检测8个目的基因不同浓度的克隆质粒,验证其敏感性;应用建立的多重PCR检测300份临床样品,并同时用荧光定量PCR和测序验证其检测结果的准确性。结果表明建立的多重GeXP-PCR方法能够分别扩增出6种病毒,8个特异性目的片段,不能扩增其他常见禽类病毒和鸡组织器官的基因;在低至100copies·20μL^(-1)的水平能同时特异性地检测出6种鸡免疫抑制病病毒核酸;检测300份临床病死鸡样品,190份样品显示为阳性,PCR和测序结果与多重GeXP-PCR结果相符。本研究建立的多重GeXP-PCR方法可特异、敏感、高通量地检测6种鸡免疫抑制性病毒,可用于临床鉴别诊断和分子流行病学调查,具有很高的临床应用价值。

河南省某养殖场猪源弯曲杆菌的分离鉴定及系统发育分析

目的探究某生猪养殖场中弯曲杆菌的污染状况,分析猪源弯曲杆菌分离株的种类,表型和基因型。方法采集生猪养殖场鼻拭子、粪便、污水、土壤、环境(地面和墙壁)涂抹物和饲料等83份样品,选择性增菌后采用滤膜法培养,根据菌落形态、生化表型和多重PCR检测进行弯曲杆菌的分离鉴定,扩增16srRNA后克隆测序,获得序列与Genbank数据库弯曲菌全基因组序列进行Blast分析,构建系统发育树,并确定弯曲菌种属。结果从猪粪便中分离9株弯曲杆菌,分离率10.84%,包括4株结肠弯曲菌(C.coli)、3株拉尼尔弯曲菌(C.lanienae)、2株豚肠弯曲菌亚种(C.hyointestinalis)。结论该生猪养殖场中的猪肠道内弯曲菌污染以结肠弯曲菌为主,种属和基因型具有多样性,分子系统发育树结果表明与国外猪源弯曲菌属具有较高同源性。

基于封闭式卡盒的现场病原体检测系统的设计与实现

目的:设计操作简单、成本低、便携和易于实现自动化等特点的小型化现场病原体检测系统,实现在传染病疫情爆发现场对传染病病原体的快速检测。方法:设计一款封闭式病原体检测卡盒,可进行一体化病原体核酸检测,并创新性地采用3D打印技术对该卡盒进行迭代设计和制造。在此基础上,研发与之配套的全自动便携式核酸检测系统,整套系统可自动化完成病原体核酸的单重检测或多重检测。结果:在卡盒和全自动便携式核酸检测系统设计完成后,分别对其进行各项性能的测试,如卡盒的气密性和移液性能,混匀性能等,测试结果均能满足病原体核酸检测的要求。以百日咳杆菌为代表,将整套系统应用于实际的病原体核酸检测,实验结果表明该卡盒系统可自动化完成核酸检测。结论:该系统能够成功地完成现场传染病从样本输入到结果输出的自动化一体化检测过程,实验结果准确可靠。

GeXP多重分析技术检测肝癌组织长链非编码RNA表达的实验研究

目的运用多重基因表达遗传分析系统(genomelab gene expression profiler,Ge XP),创建一种能同时检测肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织长链非编码RNA(long non-coding RNA,Lnc RNA)表达的一种多重逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RTPCR)检测方法,为HCC的诊断及预后提供一定的方法学基础。方法检索并筛选Pubmed数据库中近10年发表的与HCC有关报道的8种Lnc RNAs,并分别设计特异性引物。首先验证引物及多重反应体系的特异性及灵敏性,经过系统优化后建立一种多重RT-PCR检测方法。另检测23对HCC肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织标本,并用实时定量PCR技术(quantitative real-time PCR,q PCR)来验证检测体系并进行结果统计。结果优化后的Ge XP多重检测体系,特异性及灵敏性良好。另在23对HCC肿瘤组织及癌旁组织中检测到了这8种Lnc RNAs的差异表达:与癌旁组织相比,HCC组织中Lnc RNA NEAT1、H19、MALAT1、HOTAIR、DANCR、UCA1、BCAR4的表达显著下降(P均<0.05);肝癌组织中Lnc RNA GAS5的表达显著上升(P<0.05)。q PCR方法验证与Ge XP方法结果一致。结论应用Ge XP多重分析技术成功建立了一种于单管中同时检测HCC组织8种Lnc RNAs表达的检测方法,该方法有效、快捷、灵敏、特异,对HCC的诊断及预后具有启示作用并奠定了一定的方法学基础。

蚌埠市6~15岁儿童急性呼吸道感染病原谱检测分析

目的:分析蚌埠市6~15岁儿童急性呼吸道感染病原谱特征,为制定有效防控措施提供依据。方法:2022年1—8月,采集蚌埠市流感监测哨点医院流感样病例咽拭子标本1 625份,其中6~15岁儿童标本233份,每月抽取10例左右6~15岁儿童病例标本,共抽取80例。使用荧光定量PCR法进行流感病毒和新冠病毒核酸检测,应用FilmArray多重巢式PCR检测技术检测22种病原体。分析流感、新冠病毒实时荧光定量PCR检测结果,以及蚌埠市6~15岁儿童急性呼吸道感染病原体种类、不同月份急性呼吸道感染病原体构成、不同年龄段及性别急性呼吸道感染病原体检出情况、病原体检出特征。结果:1 625份送检标本,新冠检测全部阴性;流感检出阳性242例(14.89%),其中甲型季节性H3亚型阳性133例(8.18%),B型Victoria系阳性109例(6.71%)。233份6~15岁儿童标本,流感检出阳性23例(9.87%),其中甲型季节性H3亚型阳性4例(1.72%),B型Victoria系阳性19例(8.15%)。6~15岁儿童与全部人群的流感及亚型检出率比较差异无统计学意义(P>0.05)。80份呼吸道咽拭子标本中检出病原体28份(35.00%);检出7种病原体共32株,其中人鼻病毒/肠道病毒(37.50%)、B型流感病毒(34.38%)占比较高。2022年1—2月是B型流感流行高峰,其他病原体检测阳性率不同月份间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。不同年龄段、性别急性呼吸道感染病原体检出阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。28例检测阳性病例标本中,单一感染25例(89.29%),双重感染2例(7.14%),三重感染1例(3.57%),单一感染占比最高(P<0.001);检出病毒感染26例(92.86%),细菌2例(7.14%)。结论:人鼻病毒/肠道病毒和流感病毒是蚌埠市6~15岁儿童主要的急性呼吸道感染病原体,除流感病毒外,人鼻病毒等其他病原体不同时期检测阳性率比较,差异均无统计学意义。

运用自动巢式多重PCR系统对儿童重症社区获得性肺炎病原体的检测分析

目的探讨自动巢式多重PCR系统检测儿童重症社区获得性肺炎病原效果,了解佛山地区儿童重症社区获得性肺炎的病原感染情况。方法选取2016年1月至2018年12月入住佛山市第一人民医院PICU的重症社区获得性肺炎患儿,采集鼻咽分泌物,运用自动巢式多重PCR检测腺病毒、冠状病毒(HKUl型、NL63型、229E型、0C43型)、人类偏肺病毒、甲型流感病毒(H1亚型、H1-2009亚型、H3亚型)、乙型流感病毒、副流感病毒(1型、2型、3型、4型)、呼吸道合胞病毒、百日咳杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体。结果自动巢式多重PCR系统检测290份标本中,阳性246份(84.83%)。单一病原阳性样本166份,检出2种病原阳性样本60份,3种病原阳性样本17份,4种病原阳性样本3份。病毒检出阳性病例中,小于6月龄最常见病原为呼吸道合胞病毒(62.39%,73/117);7月龄~1岁最常见病原体为人鼻病毒/肠病毒(3.48%,20/46);1~3岁患儿最常见病原为腺病毒(37.50%,18/48);3~6岁最常见病原为人鼻病毒/肠病毒(35.00%,7/20);大于6岁最常见病原为流感病毒(46.67%,7/15)。腺病毒检出率每年5月份最高,呼吸道合胞病毒检出率8月份最高,流感病毒检出率7月份最高,肺炎支原体及百日咳杆菌感染全年均有散发。结论自动巢式多重PCR系统可高效、快速、准确检测多种病原;不同年龄组重症社区获得性肺炎的常见病原体不同;不同地区因气候不同,常见病原的流行季节不同。

多重PCR对大肠杆菌的毒力基因分型与系统进化分类的研究

本文对不同来源大肠杆菌的毒力基因分布情况进行调查及系统进化分类,探讨大肠杆菌的系统进化分类与毒力基因携带的关联。本研究针对引起人类和动物肠道内或肠道外疾病的6种病原型大肠杆菌的47个毒力基因,采用多重PCR方法对38株大肠杆菌和4株志贺氏菌进行毒力基因的分布调查及系统进化分类。肠道致病大肠杆菌中携带其病原型标志毒力基因和多种肠外致病大肠杆菌的毒力基因;非致病性大肠杆菌也携带某些肠外致病大肠杆菌的毒力基因,但是两者都不含肠道致病大肠杆菌的毒力基因。对42株菌的系统进化分类结果表明,大多数肠外致病大肠菌株属于B2或D。肠道临床菌株中大部分被归为D(19.2%)、B1(50.0%)和A(30.8%),3株非致病性菌株DH5α、BL-21和XL-10属于A。大肠杆菌毒力基因的携带和系统进化之间有很显著的联系,肠道内与肠道外的感染与不同的毒力基因相关联。

基于GeXP系统的同时检测16种呼吸道病毒的多重PCR方法的建立

在GeXP系统J二，Li等建立了一种毛细管电泳仪的一步法多莺逆转录PCR方法，可以存一次检测中同时检测16种呼啵道病毒，包括甲型，乙型流感病毒、季节性流感病毒H1N1亚型、副流感病毒1—3型、人鼻病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒感染A型和B型、冠状病毒NL63、

GeXP多重PCR技术同时检测12种常见呼吸道病毒

本研究建立了一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的多重RT—PCR检测方法，该方法可以同时检测12种呼吸道病毒，包括流感病毒A型和B型、季节性H1N1、副流感病毒1～3型、人鼻病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒A型和B型、人博卡病毒。针对病原体保守区序列设计12种病毒的特异性引物，分别用已验证的阳性标本为模板检验多重体系的特异性。多重检测体系在10^3拷贝／μL水平可同时检测到12种病毒。另检测24份临床标本，以realtime RT—PCR为参考标准，进一步验证检测体系。结果表明，这种基于GeXP系统的新方法灵敏度高、特异性强，可以快速同时检测12种常见呼吸道病毒。

2006-2008年江苏地区不同宿主感染空肠弯曲菌及其耐药性

目的检测2006-2008年江苏地区鸡、水禽、奶牛、丹顶鹤、猪、实验猴等标本感染空肠弯曲菌及其耐药性。方法采用APICampy System进行生化与分类鉴定,结合弯曲菌多重PCR检测方法对来自江苏地区的禽、牛、猪、猴3 010份标本,检测分离株及其耐药性。结果共检测样本3010份,402份空肠弯曲菌阳性,阳性率13.36%,其中家禽样阳性率15.83%(258/1630);水禽10.40%(52/500);奶牛7.65%(39/510);猪18.75%(30/160);猴15.00%(15/100);丹顶鹤12.50%(10/80);糜鹿0%(0/30)。选择不同宿主来源的108株对10大类27种抗生素高度敏感率的是:氯霉素100%、阿莫西林99.07%、阿米卡星92.59%、头孢噻肟91.67%、阿齐霉素90.74%;高度耐药率的是:头孢哌酮99.07%、复方新诺明99.07%、头孢孟多99.07%、磺胺甲基异噁唑97.22%、头孢拉丁91.67%。结果显示,108株分离株的耐药主要集中在9耐～20耐,占85.19%,猪分离株的多重耐药性较其它宿主来源分离株严重。结论江苏地区空肠弯曲菌的流行和耐药状况呈现多样化和复杂化,不同宿主来源分离株耐药性和多重耐药性存在差异。