不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉内皮细胞分泌相关蛋白及细胞因子的影响

背景:牙龈卟啉单胞菌感染是近年发现与动脉粥样硬化等多种疾病发生有关的危险因素,但不同fimA基因型的牙龈卟啉单胞菌致病能力不同,积极探明牙龈卟啉单胞菌高危菌株对于完善动脉粥样硬化诊疗机制具有重要作用。目的:探讨不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉内皮细胞分泌单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6、内皮素1/一氧化氮的影响。方法:厌氧条件下对Ⅳ、Ⅱ、ⅠfimA基因型牙龈卟啉单胞菌进行培养,应用感染复数值为100感染人脐静脉内皮细胞,同时设阳性对照组为牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激人脐静脉内皮细胞、阴性对照组人脐静脉内皮细胞仅加细胞培养液培养。采用酶联免疫吸附法检测各组培养2,6,24 h后人脐静脉内皮细胞培养上清液中单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6、内皮素1/一氧化氮水平。结果与结论:除阴性对照组外,其他4组人脐静脉内皮细胞培养上清液中白细胞介素6、内皮素1/一氧化氮、单核细胞趋化蛋白1水平逐渐增高,且ⅣfimA基因型刺激组白细胞介素6、内皮素1/一氧化氮水平高于Ⅱ、ⅠfimA基因型刺激组及阳性对照组、阴性对照组(P<0.05);ⅡfimA基因型刺激组单核细胞趋化蛋白1水平高于Ⅳ、ⅠfimA基因型刺激组、阴性对照组(P<0.05)。结果表明,不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌刺激人脐静脉内皮细胞功能紊乱机制存在一定差异,Ⅱ、ⅣfimA基因上调单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6、内皮素1/一氧化氮分泌能力较强,可能在引起血管内皮细胞功能紊乱中占主导地位。

肠炎沙门菌菌毛重组蛋白对其细胞黏附的竞争性阻断效应

鸡沙门菌通过其菌毛、鞭毛黏附宿主小肠上皮细胞是其致病过程不可或缺的重要环节。本研究旨在分析原核表达的菌毛重组蛋白FimA-sefA对肠炎沙门菌黏附小肠上皮细胞(IPEC-J2)竞争性阻断效应。将FimA、sefA基因片段克隆至pET28a(+),构建重组质粒pET28a-FimA-sefA,转化至菌株BL21(DE3)经镍柱亲和层析法(Ni-NTA)纯化获得重组蛋白FimA-sefA;利用间接免疫荧光法(IFA)、平板计数法分析肠炎沙门菌对IPEC-J2细胞的黏附。结果显示:表达的重组蛋白FimA-sefA分子量为36 ku;重组蛋白FimA-sefA、重组菌及肠炎沙门菌均能黏附IPEC-J2细胞;重组蛋白FimA-sefA及重组菌均能竞争性阻断肠炎沙门菌对IPEC-J2细胞的黏附,重组菌的阻断效应强于重组蛋白。因此,我们认为重组蛋白FimA-sefA能够在一定程度上竞争性阻断肠炎沙门菌对IPEC-J2细胞的黏附,为预防及减轻肠炎沙门菌感染策略提供了新的思路。

牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白的重组及表达

目的克隆Ⅱfi m A型牙龈卟啉单胞菌菌毛fi m A基因并使其在结肠埃希菌中正确表达。方法利用聚合酶链反应技术克隆Ⅱ型fi m A基因,经酶切和测序验证后构建原核表达质粒p ET-Fim A,使其在结肠埃希菌中表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot鉴定表达产物。结果克隆基因测序结果与Gene Bank数据库中的序列呈现95%同源性,成功构建fi m A基因原核表达载体p ET-Fim A。结论高效表达出Ⅱfi m A型重组菌毛蛋白,并获得较高纯度,且具有免疫原性和免疫反应性。

CTB-FimA融合蛋白原核表达纯化及其免疫效果

[目的]构建牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)菌毛蛋白(FimA)与霍乱毒素B亚基(CTB)重组质粒pET-32a/CTB-FimA,表达纯化CTB-FimA融合蛋白并对其黏膜免疫效果进行研究。[方法]根据GenBank查找FimA基因和CTB基因,利用(Gly4Ser)3连接肽序列构建pET-32a/CTB-FimA原核表达质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),确定IPTG诱导浓度及温度,SDS-PAGE分析目的蛋白的可溶性;采用亲和层析和凝胶过滤层析纯化目的蛋白CTB-FimA;用纯化的目的蛋白作为免疫原鼻腔滴注免疫BALB/c小鼠观察其黏膜免疫效果。[结果]经双酶切和测序鉴定pET-32a/CTB-FimA重组表达质粒构建成功;IPTG最适诱导浓度为0.5 mmol/L,最适诱导温度为23℃,重组蛋白CTB-FimA主要以可溶形式表达;Expasy软件ProtParam工具预测重组蛋白分子量约为72.08 kDa,亲水性总平均值为-0.313;每升发酵液表达CTB-FimA蛋白约100 mg;免疫BALB/c小鼠产生sIgA抗体效价显著高于对照组。[结论]成功构建pET-32a/CTB-FimA重组蛋白表达质粒,获得可溶性CTB-FimA重组蛋白,鼻腔滴注免疫BALB/c小鼠能够产生高效价的sIgA抗体,为防治口腔牙龈卟啉单胞菌感染疫苗的研制奠定基础。

牙龈卟啉单胞菌菌毛质粒构建和蛋白纯化

目的:构建牙龈卟啉单胞菌菌毛基因原核表达质粒,纯化菌毛融合蛋白。方法:提取牙龈卟啉单胞菌DNA,通过PCR法克隆菌毛基因,构建质粒并转化至感受态细胞中,选取最佳条件诱导融合蛋白,通过谷胱甘肽巯基转移酶亲和层析法,纯化融合蛋白;免疫印迹法验证蛋白的准确性。结果:实验显示低温高浓度诱导12 h时构建的质粒融合蛋白表达量最多;免疫印迹法检测在预期大小处显示特异性印迹条带。结论:成功的获得了纯度较高的牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白。

牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因在大肠杆菌的融合表达

目的:克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因,并使其在大肠杆菌中融合表达。方法:利用PCR方法克隆fimA,并用基因重组融合表达技术获得在大肠杆菌中的表达。结果:克隆基因测序结果与GenBank数据库中的序列呈现99.9%同源性;经诱导表达后可观察到Mr 38kDa的融合蛋白。结论:成功克隆了fimA基因,并在大肠杆菌中表达了FimA蛋白,为后续研究奠定了基础。

肺炎克雷伯菌FimA的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的表达及纯化肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)菌毛FimA蛋白并制备多克隆抗体。方法在Clustal Omega网站上比对不同细菌FimA蛋白的同源性。设计特异引物,PCR扩增肺炎克雷伯菌FimA基因,双酶切后将其连接到表达质粒pET28a,构建重组质粒pET28a-FimA。将pET28a-FimA转化表达菌BL21 star(DE3)后培养,使用IPTG诱导FimA蛋白表达。使用IEDG在线网站分析FimA蛋白的B细胞表位,然后用层析纯化的重组FimA蛋白免疫小鼠,获得免疫血清,ELISA检测IgG、IgG1、IgG2a和IgA.结果肺炎克雷伯菌的FimA与其他FimA蛋白同源性较低,为23.6%?30.6%。构建的重组质粒PET28a-FimA在大肠埃希菌中能表达21.6×10^3的重组FimA蛋白,经亲和层析后得到单一电泳条带的高纯度目的蛋白。用FimA蛋白免疫小鼠,获得高滴度的IgG和IgA,且IgG2a的A450值高于IgG1.结论成功构建了表达质粒pET28a-FimA,获得高纯度的重组蛋白FimA。FimA具有免疫原性,用该蛋白免疫小鼠获得高滴度的多克隆抗体。