狂犬病病毒Vero细胞适应株3aG-V的致病性和免疫原性

狂犬病病毒3aG-V株是3aG-5在Vero细胞适应的毒株,对其在小鼠、豚鼠、家兔、犬的不同感染途径的致病性,小鼠、豚鼠、兔子上的免疫原性进行研究,同时进行纯毒及在中枢神经系统中能否形成尼氏小体试验,结果表明:狂犬病病毒3aG-V株潜伏期较长,在动物脑内不形成尼氏小体,为固定毒,其在实验动物上具有较弱的致病性和较好的免疫原性,可作为纯化Vero细胞狂犬病疫苗的生产用疫苗株。

狂犬病病毒aG株假病毒的制备方法

基于HIV慢病毒包装系统建立了狂犬病病毒(RV)aG株假病毒的制备方法。构建编码RV aG株糖蛋白(GP)的重组真核表达质粒pCMV-aG-G,转染至293T细胞验证GP的表达。将GP表达质粒与假病毒包装质粒及绿色荧光蛋白(GFP)指示质粒共转染293T细胞进行假病毒包装,制备携带GFP报告基因与aG株GP的RV假病毒。结果表明,研究成功构建了编码RV aG株GP的重组真核表达质粒,其可在293T细胞中有较高表达;成功制备了具有细胞感染性的RV aG株假病毒。本研究有助于更安全、准确监测针对我国现用人狂犬病疫苗生产用RV固定毒aG株的中和抗体水平。

狂犬病固定毒aG株在Vero细胞上的传代适应研究

目的 为研制安全 ,有效和使用方便的Vero细胞狂犬疫苗提供基础资料。 方法 对狂犬病固定毒 3aG株在Vero细胞上的传代适应性进行了研究 ,同时进行了狂犬病毒在Vero细胞上繁殖最适条件的选择实验。 结果 狂犬病固定毒 3aG株在Vero细胞上多次传代后得到高滴度表达毒力可达 8 3LogLD50 /ml,具有较好的抗原性及免疫原性 ,并且确定了狂犬病病毒在Vero细胞上繁殖的最适条件 ,即种毒量在 0 1～ 0 0 1LD50 /cell之间病毒滴度最高。 结论 3aG -V毒株在Vero细胞上繁殖可维持相当长时间 ,并可进行多次加液 ,检测证实多次收获毒液毒力均达到疫苗制造要求。

用CaG株毒种制备精制狂犬病疫苗的研究

通过对狂犬病毒aG株在金黄地鼠肾细胞上传代培养 ,获得一种新型狂犬病毒毒株 ,即地鼠肾细胞适应株(CaG株 ) [1] 。由于该毒种具有生产方法简单 ,成本低廉 ,且外源因子污染机率小等优点 ,因此试用该毒种生产精制狂犬病疫苗。在相同条件下 ,分别用豚鼠脑毒种和细胞毒种各生产 3批病毒原液 ,经相同纯化工艺制备成精制狂犬病疫苗。经初步检定用细胞毒种制备的疫苗安全性良好 。

狂犬病毒aG株在Vero细胞上传代适应研究

为研制有效、安全和稳定的Vero细胞狂犬病疫苗提供实验室基础资料。采用狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上进行传代适应,同时对该毒株在Vero细胞上的增殖条件,病毒液的回收方法进行研究。结果显示,狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上多次传代后获得一株Vero细胞适应株(4aG-V株),该毒株的毒力可达8.50 logLD50/ml,且具有很好的抗原性及免疫原性。结果表明,感染Vero细胞最适种毒比例为1∶103,病毒滴度随着时间的延长而增强到第12天后逐渐减弱,且采用低温冻融破碎法回收的病毒液滴度优于直接收液法。4aG-V株在Vero细胞上维持时间长,可连续收液,有望其生产高滴度的狂犬病毒液。

狂犬病病毒aG株全基因组序列测定及遗传稳定性分析

目的探究狂犬病病毒（Rabies virus,RV）aG株全基因组序列特征及遗传稳定性。方法严格按疫苗生产工艺进行传代,提取主种子批、工作种子批及疫苗原液病毒RNA,通过RT-PCR技术扩增全基因组各片段基因,然后分别将其克隆到p GEM-T载体中,并进行序列测定;采用DNAStar软件包对aG株与Gen Bank中4aGV参考株（JN234411）以及18株基因1型RV参考株进行同源性分析。结果 aG株全基因组由11 925个核苷酸组成,共编码3 600个氨基酸。疫苗原液与主种子批全基因组核苷酸和氨基酸同源性均为100%,而工作种子批与主种子批的核苷酸与氨基酸同源性分别为99.97%和99.92%;aG株与4aGV参考株全基因组核苷酸与推导的氨基酸同源性均为99.9%,其与18株基因1型参考株核苷酸与氨基酸序列同源性分别为84.2%~97.6%和93.7%~98.3%;aG株传代病毒与4aGV参考株全基因组氨基酸序列高度保守,且各主要功能区未发生变异。结论狂犬病病毒aG株在实验室长期生产传代过程中,全基因组遗传特性稳定。

减毒狂犬病病毒CTN181-3株免疫学特性研究

目的对本室研发的1株狂犬病减毒株CTN181-3的免疫学特性进行研究。方法以小鼠和金黄地鼠为模型,口腔或肌肉免疫1次后考查暴露前免疫;以金黄地鼠为模型,肌肉免疫考查暴露后免疫。结果CTN181-3株经小鼠和金黄地鼠分别口腔或肌肉免疫1次均能产生高滴度的中和抗体和良好的攻击保护效果;经小鼠口腔和肌肉免疫早期即开始产生细胞因子IFN-γ和IL-2,诱发有效的细胞免疫。以金黄地鼠为模型的暴露后免疫结果显示:肌肉免疫1次的保护率为50%,而免疫2次的保护率可达100%。结论CTN181-3株具有良好的体液免疫和细胞免疫保护效果,而且暴露后2次免疫不必接种免疫球蛋白即可达到100%有效保护,其免疫性强、保护效果好,是一种很有应用前景的狂犬病动物用候选疫苗株。

博莱霉素A_5的类酶性研究

研究了博莱霉素Ａ５（ＢＬＭＡ５）与ＤＮＡ作用前后的光谱性质及初步的动力学性质，发现ＢＬＭＡ５可催化ＤＮＡ氧化断链，而且符合米氏动力学．通过对ＢＬＭＡ５的催化效率、底物专一性以及温度、ｐＨ、金属离子对ＢＬＭＡ５催化ＤＮＡ断链反应影响的研究，发现ＢＬＭＡ５的作用行为在许多方面与酶的催化行为非常类似，提出ＢＬＭＡ５是一种小分子生物催化剂的看法．

1株狂犬病毒减毒株的毒力和分子特性研究

目的对实验室研发的1株狂犬病减毒株CTN181-3的致病性和基因型特性进行研究。方法用小鼠脑内、口腔接种法和金黄地鼠口腔接种法测定病毒毒力。将病毒通过乳鼠脑内、豚鼠颌下腺和细胞连续传多代,测定传代后病毒的遗传稳定性。对CTN181-3进行全基因组测序,并与其亲本株进行对比分析。结果CTN181-3对实验动物毒力高度减弱,对3周龄小鼠无论脑内或口腔接种均无致病性,对2周龄小鼠也表现出脑内低毒力;口腔接种8周龄金黄地鼠亦无发病死亡。遗传稳定性方面,经1~3 d龄乳鼠脑内连续传5代或豚鼠颌下腺传4代,传代增殖后的病毒滴度虽高达7.10 lg PFU/mL或7.63 lg PFU/mL,对小鼠脑内接种仍保留无致病力的弱毒特性;在BSR细胞和Vero细胞上分别传10代,表型特性稳定。全基因组测序结果分析显示CTN181-3株与国内近年来分离株的同源性高于其他疫苗株与国内分离株的同源性。CTN181-3株与其原始的亲本株CTN-1比较,发生8个氨基酸位点的突变,其中G276 L→V和L1496 M→W氨基酸的突变在CTN181株未发生,为CTN181-3株所特有。因此,这2个位点的氨基酸突变应该是CTN181-3株比CTN181株毒力更弱、遗传稳定性更高的分子基础。结论CTN181-3株的神经毒力高度减弱,毒力稳定,是一种很有应用前景的动物用狂犬病候选疫苗株。

狂犬病病毒aG株在人用狂犬病疫苗中应用的研究进展

狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的以中枢神经系统症状为主的一种动物源性传染病,病死率几乎100%,狂犬病疫苗是预防狂犬病的主要手段。1931年,研究者从狂犬病病犬脑中分离获得狂犬病病毒,经兔脑传至30多代,经驯化后获得一种固定毒(北京株),后续经多家机构合作,将狂犬病病毒北京株在豚鼠脑和原代地鼠肾细胞中交替传代15年,获得地鼠肾细胞适应株,即aG株,用于人用狂犬病疫苗生产。本文就狂犬病病毒aG株的传代适应方法、基因特性及其制备相应疫苗的免疫保护作用作一综述。

狂犬病疫苗株病毒aG株全基因序列测定及特征分析

对我国狂犬病疫苗生产株aG株进行全基因序列测定分析,为完善aG株毒种的质量控制提供数据支持。将aG株病毒全基因组RNA分成8段进行RT-PCR分段扩增,其中基因组5′末端采取5′RACE方法,将PCR扩增产物分别克隆入pGEM-T载体中,测定序列并拼接获得病毒全基因序列;用DNAStar软件包中的相应软件对基因全序列进行分析,并与国内外主要狂犬病疫苗生产株进行基因同源性分析和主要抗原位点比较。aG株病毒基因组序列全长11 925bp(GenBank登录号为JN234411),属基因Ⅰ型狂犬病病毒;各疫苗株生物信息学分析表明,各株病毒存在同源性差异。本研究获得了aG株病毒全基因组序列,对aG株基因特征进行了分析并将其与国内外疫苗株进行了比较,为完善其质量控制提供了参考和数据支持。

狂犬病病毒aG株糖蛋白遗传稳定性及生物信息学分析

目的研究狂犬病病毒(rabies virus,RV)aG株糖蛋白(glycoprotein,GP)的遗传稳定性,并对GP基因组进行序列测定及生物信息学分析。方法采用RT-PCR法扩增6代次aG株RV(4aGV4、4aGV5、4aGV7、4aGV11、4a-GV15、4aGV18)G区基因,分别将产物克隆入pGEM-T载体中,测定序列并进行拼接;测定6代次aG株RV的滴度、荧光滴度和毒力;应用DNAStar和Mega4.0软件包中的相应软件对基因组序列进行分析,并与我国近期分离且具有地域代表性的RV街毒株进行基因同源性分析。结果 6代次aG株RV GP基因保持高度稳定,未出现核苷酸突变位点;6代次aG株RV的滴度有所不同,但其毒力指标基本一致;RV aG株与我国街毒流行株GP抗原区具有较高的同源性,且膜外区同源性远高于跨膜区及膜内区;aG株RV第147位关键位点氨基酸与街毒流行株该位点不同,其余各关键抗原位点在各毒株间均高度同源;6代次aG株RV关键毒力位点均未出现氨基酸突变,传代稳定,aG株RV与各街毒流行株关键毒力位点均高度同源;aG株病毒信号肽结构与我国多株流行株高度同源,而其GP则与法国巴斯德原株PV2061株及分离自美国的HEP-Flury株高度同源,与我国流行街毒株亦具有较高的同源性。结论 RV aG株GP遗传稳定,且与我国近期分离的街毒株高度同源,本研究为完善该毒株的质量控制及全面评价其在我国的适用性提供了实验依据。

狂犬病病毒4aG株G蛋白基因的克隆及其生物信息学分析

目的克隆狂犬病病毒(Rabies virus,RV)4aG株G蛋白基因,并与其他疫苗毒株G蛋白基因序列进行比较,为我国狂犬病疫苗的研制提供理论依据。方法从RV 4aG株中扩增G蛋白基因,并进行序列测定,利用生物信息学软件绘制系统进化树,预测G蛋白功能位点、二级结构和B细胞抗原表位,并与其他疫苗毒株进行比较。结果克隆的4aG株G蛋白基因序列与GenBank中登录的序列一致。进化树分析显示,4aG株与CVS株的进化关系较远;4aG、4aGV18、CVS、PV及RC-HL毒株跨膜区域在第460～479氨基酸之间,其他毒株在459～478氨基酸之间;PV株有5个糖基化位点,RV-97株有3个糖基化位点,其他毒株均有4个糖基化位点;G蛋白抗原表位位于氨基酸100～300及480～520之间;不同毒株G蛋白抗原位点区域有所不同,与CVS株比较,PV株抗原表位与其最为接近,4aG、4aGV18、CTN-1-31及Flury-HEP株与其抗原表位较为接近。结论4aG株G蛋白功能位点和抗原表位与CVS株相差较大,但其在Vero细胞上传代稳定,可用于制备Vero细胞纯化疫苗。

人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)的免疫原性评价

目的研究狂犬病病毒aG株生产的人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)免疫接种后抗体动态水平,评价疫苗的免疫原性,并对企业A和企业B生产的狂犬病疫苗进行效力评价。方法采用企业A和B生产的人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)(简称狂苗)按暴露后免疫程序接种受试者,分别于免疫前、第1针免疫后3、7、14、42 d抽血并分离血清,用快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)检测中和抗体滴度,比较2组受试者血清样本的抗体阳转率和抗狂犬病中和抗体滴度;并对2015年1月至2023年3月企业A和企业B申报批签发的狂苗抽检效价结果进行回顾性分析,效力检测采用《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2020版(三部)人用狂犬病疫苗效价测定法。结果企业A和企业B生产的狂苗第1针免疫后7 d抗体阳转率分别为50.6%、51.5%,14、42 d阳转率均为100%,抗体阳转率差异无统计学意义(χ^(2)=0.0161,P=0.899);第1针免后7 d中和抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)分别为1.5、2.2 IU/mL,差异无统计学意义(t=0.316,P=0.752);第1针免后14 d的GMT分别为5.7、8.7 IU/mL,差异无统计学意义(t=0.864,P=0.388);第1针免后42 d的GMT分别为9.7、9.8 IU/mL,差异无统计学意义(t=0.092,P=0.925)。参照《中国药典》2015版附录3503和《中国药典》2020版附录3503第一法(NIH法)检测的企业A和企业B的疫苗效价几何均值分别为6.8和6.0 IU/剂,差异无统计学意义(t=1.699,P=0.094)。参照《中国药典》2020版附录3503第二法(改良NIH法)检测的企业A和企业B生产的狂苗效价均≥4.0 IU/剂。结论2家企业利用狂犬病病毒aG株在原代地鼠肾细胞上生产的狂苗均可以及时地在人体内诱导产生保护性抗体,回顾分析表明效价检测结果全部符合规定,疫苗具有良好的免疫原性。

狂犬病病毒固定株PV2061在人二倍体细胞MRC-5上适应株的建立

目的建立狂犬病病毒固定株PV2061在人二倍体细胞MRC-5上的适应株,为狂犬病疫苗研究提供生产用毒株。方法将狂犬病病毒固定株PV2061接种于MRC-5细胞并进行连续性传代,通过对感染剂量(1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500)、收获天数(4、7、10、13、16 d)及感染方式(混种感染、吸附感染、带毒传代)的优化,确定在MRC-5细胞上的培养条件,并分析不同层析介质(Sepharose 4FF、Sepharose 6FF)对狂犬病病毒分离纯化效果的影响。结果狂犬病病毒固定株PV2061能较好地适应MRC-5细胞,通过连续性传代,在第4代病毒滴度可达6.0 lgLD_(50)/mL以上,11~19代病毒滴度稳定在6.5 lgLD_(50)/mL。感染剂量在1∶100~1∶500范围内,病毒滴度均能达6.0 lgLD_(50)/mL以上;病毒峰值主要集中在8~13 d;混种感染和带毒传代优于吸附感染,病毒滴度均在5.5 lgLD_(50)/mL以上。与Sepharose 6FF相比,Sepharose 4FF能有效去除总蛋白质,两种介质对抗原回收率均在85%~120%范围内,牛血清白蛋白残留量均低于50 ng/mL。结论建立了MRC-5细胞传代适应的狂犬病病毒适应株MPV2061,为后续人用狂犬病疫苗生产工艺的研究提供了数据支持。