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Gene cloning and prokaryotic expression of recombinant flagellin A from Vibrio parahaemolyticus 被引量:2
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作者 袁野 王秀利 +3 位作者 郭设平 刘洋 葛辉 仇雪梅 《Chinese Journal of Oceanology and Limnology》 SCIE CAS CSCD 2010年第6期1254-1260,共7页
The Gram-negative Vibrio parahaemolyticus is a common pathogen in humans and marine animals. Bacteria flagellins play an important role during infection and induction of the host immune response. Thus, flagellin prote... The Gram-negative Vibrio parahaemolyticus is a common pathogen in humans and marine animals. Bacteria flagellins play an important role during infection and induction of the host immune response. Thus, flagellin proteins are an ideal target for vaccines. We amplified the complete flagellin subunit gene (tTaA) from V. parahaemolyticus ATCC 17802. We then cloned and expressed the gene into Escherichia coli BL21 (DE3) cells. The gene coded for a protein that was 62.78 kDa. We purified and characterized the protein using Ni-NTA affinity chromatography and Anti-His antibody Western blotting, respectively. Our results provide a basis for further studies into the utility of the FlaA protein as a vaccine candidate against infection by Vibrio parahaemolyticus. In addition, the purified FlaA protein can he used for further functional and structural studies. 展开更多
关键词 Vibrio parahaemolyticus flagellin subunit gene (flail) CLONING prokaryotic expression characterization
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蒜芥茄SsFLS2基因的克隆及其表达分析
2
作者 孙茂 吴丽艳 +4 位作者 龚亚菊 鲍锐 桂敏 黎志彬 杜光辉 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第8期1669-1676,共8页
【目的】克隆云南野生蒜芥茄(Solanum sisymbriifolium Lam.)中的FLS2基因,并对其编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、系统进化以及表达情况予以分析,初步探究野茄FLS2基因在黄萎病胁迫下的生物学功能。【方法】基于前期所测转录组数据(... 【目的】克隆云南野生蒜芥茄(Solanum sisymbriifolium Lam.)中的FLS2基因,并对其编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、系统进化以及表达情况予以分析,初步探究野茄FLS2基因在黄萎病胁迫下的生物学功能。【方法】基于前期所测转录组数据(蒜芥茄接种黄萎病病原菌),克隆获取蒜芥茄FLS2基因,命名为SsFLS2;利用生物信息学分析软件对SsFLS2基因的理化性质进行分析,并通过实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测其在蒜芥茄根、茎、叶的表达以及在接种黄萎病病原菌后不同时间的表达情况。【结果】蒜芥茄SsFLS2基因全长3655 bp,具有完整的ORF框,编码1126个氨基酸。其编码蛋白的分子式为C_(5596)H_(8814)N_(1494)O_(1627)S_(4),理论分子量为124.34 kD,理论等电点(pI)为7.33,总平均亲水性系数为0.081。该蛋白二级结构主要由42.81%的无规则卷曲、40.23%的α-螺旋、13.23%的延伸链以及3.73%的β-折叠组成,且存在跨膜结构,定位于细胞膜上,其中可被磷酸化且超过阈值线的位点,共计151个。SsFLS2蛋白的氨基酸序列与马铃薯(Solanum tuberosum)同源蛋白(XP 006358149.2)的关系最近。RT-qPCR检测发现,在蒜芥茄根、茎、叶中均有SsFLS2基因的表达,且根、叶中的相对表达量极显著高于茎部;接种黄萎病病原菌后72 h内,处理组和对照组均在24 h时,SsFLS2基因的相对表达量大幅度增加且极显著高于其他时间点。【结论】本研究成功克隆蒜芥茄的SsFLS2基因,并对其编码蛋白的理化性质及基因表达情况等进行分析。结果表明,SsFLS2是蒜芥茄响应黄萎病胁迫的重要基因,结果可为进一步研究该基因在蒜芥茄黄萎病抗性中的功能奠定基础。 展开更多
关键词 蒜芥茄 flagellin sensing 2(FLS2) 基因克隆 生物信息学 基因表达
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转燕麦噬酸菌蛋白激发子基因flagellin的链霉工程菌株构建及鉴定
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作者 吴琼 林振亚 +3 位作者 李莹莹 李雅乾 高士刚 陈捷 《上海交通大学学报(农业科学版)》 2013年第1期56-60,共5页
利迪链霉菌A01可以产生大量的抗生素——纳他霉素,其通过结合病原真菌细胞膜上的甾醇分子而起到抑制病原菌生长的作用。燕麦噬酸菌的鞭毛蛋白组分FLAGELLIN可以诱导植物抗性,激发活性氧及水杨酸防御反应途径。本研究将燕麦噬酸菌蛋白激... 利迪链霉菌A01可以产生大量的抗生素——纳他霉素,其通过结合病原真菌细胞膜上的甾醇分子而起到抑制病原菌生长的作用。燕麦噬酸菌的鞭毛蛋白组分FLAGELLIN可以诱导植物抗性,激发活性氧及水杨酸防御反应途径。本研究将燕麦噬酸菌蛋白激发子基因flagellin克隆,接合转移入利迪链霉菌A01中,使工程菌增加诱导植物抗性的功能。PCR验证表明:成功获得了含flagellin基因的阳性工程菌株,证明通过链霉工程菌构建可实现抗生与诱抗的协同作用,预计会提高防治植物病害的效果。 展开更多
关键词 利迪链霉菌A01 燕麦噬酸菌flagellin基因 工程菌株
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鞭毛蛋白诱导表达差异基因的分析 被引量:1
4
作者 李双 杨泽敏 +1 位作者 廖义潇 杨颖 《饲料研究》 CAS 北大核心 2023年第4期69-74,共6页
试验旨在分析鞭毛蛋白刺激机体基因表达谱的特征,揭示鞭毛蛋白佐剂的作用机制。从GEO数据库筛选目标微阵列GSE46421和GSE72016及其差异表达基因(DEGs),经DAVID分析DEGs参与的GO功能注释和KEGG信号通路、String构建DEGs的蛋白质-蛋白质... 试验旨在分析鞭毛蛋白刺激机体基因表达谱的特征,揭示鞭毛蛋白佐剂的作用机制。从GEO数据库筛选目标微阵列GSE46421和GSE72016及其差异表达基因(DEGs),经DAVID分析DEGs参与的GO功能注释和KEGG信号通路、String构建DEGs的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络、Cytoscape可视化PPI网络并筛选高连通度的PPI子模块和hub基因。结果显示,共筛选出182个DEGs,包含上调基因161个、下调基因121个。DEGs参与GO生物过程主要有信号转导、免疫应答、炎症反应、细胞凋亡等,参与分子功能包含激酶激活、受体结合、细胞因子激活、膜信号转导。DEGs参与KEGG通路涵盖细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路等免疫相关途径。分析DEGs的PPI网络发现,2个重要的PPI子模块和10个关键基因(IL-10、IL-6、CCL2、CXCL2、NFKBIA、MyD88等)。研究表明,鞭毛蛋白通过识别TLR5和NOD样受体,触发MyD88依赖性和MyD88非依赖性途径发出信号,激活转录因子NF-κB,这些信号通过级联反应激活机体免疫系统、诱导机体产生多种细胞因子和趋化因子,发挥佐剂效应。 展开更多
关键词 鞭毛蛋白佐剂 GO分析 KEGG分析 PPI分析 hub基因
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溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaB基因的克隆及原核表达 被引量:9
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作者 梁海鹰 夏立群 +2 位作者 吴灶和 简纪常 鲁义善 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期139-146,共8页
参照GenBank上登录的弧菌鞭毛蛋白flaB基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaB全长基因,序列分析结果显示该基因为1134bp,编码377个氨基酸。与GenBank中其它弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaB基因与副溶血弧菌flaB基因... 参照GenBank上登录的弧菌鞭毛蛋白flaB基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaB全长基因,序列分析结果显示该基因为1134bp,编码377个氨基酸。与GenBank中其它弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaB基因与副溶血弧菌flaB基因的同源性最高(92%)。将该基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出带His-tag的融合蛋白,分子量大小与预期一致。优化的表达条件为28℃,0.4mmol/LIPTG浓度诱导10h。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,制备了多克隆抗体。Western-blotting结果表明鼠抗FlaB血清不仅能与诱导后的重组蛋白发生反应,而且能与天然的溶藻弧菌全菌蛋白发生反应,提示鞭毛蛋白FlaB可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一,为下一步进行FlaB蛋白免疫原性的研究以及疫苗的制备奠定了基础。 展开更多
关键词 溶藻弧菌 鞭毛蛋白 flaB基因 原核表达
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鞭毛素fliC基因的缺失对肠炎沙门氏菌生物膜形成的影响 被引量:6
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作者 朱春红 董立伟 +4 位作者 张江英 谢静 李芙蓉 陆广富 朱国强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期303-306,共4页
为研究肠炎沙门氏菌鞭毛素对其生物膜形成的影响,本研究利用构建的肠炎沙门氏菌鞭毛素编码基因fliC缺失株,检测其缺失性修饰后的生长表型变化及其对生物膜形成的影响。结果显示在表型检测试验中,fliC缺失株在电镜下观察呈无鞭毛形态,在... 为研究肠炎沙门氏菌鞭毛素对其生物膜形成的影响,本研究利用构建的肠炎沙门氏菌鞭毛素编码基因fliC缺失株,检测其缺失性修饰后的生长表型变化及其对生物膜形成的影响。结果显示在表型检测试验中,fliC缺失株在电镜下观察呈无鞭毛形态,在半固体培养基上缺乏运动性,并且不能与肠炎沙门氏菌鞭毛单克隆抗体发生可见的凝集反应。生物膜形成能力定性试验结果表明,肠炎沙门氏菌fliC缺失株生物膜形成大量减少,并且生物膜脆弱,而其回补株能够较好地恢复生物膜的形成;生物膜定量结果进一步证明,鞭毛素fliC基因缺失后肠炎沙门氏菌形成生物膜的能力下降50%左右,以上结果显示鞭毛在肠炎沙门氏菌体外生物膜形成中具有重要作用。 展开更多
关键词 肠炎沙门氏菌 鞭毛素 fliC基因 生物膜
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聚合酶链反应检测空肠和结肠弯曲菌的核酸 被引量:3
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作者 周志平 王勇 +3 位作者 虞爱华 马立人 王军 刘耀清 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 1998年第2期79-81,共3页
为了解急性腹泻病人空肠和结肠弯曲菌的感染率,建立了空肠和结肠弯曲菌的PCR检测方法。引物设计在结肠弯曲菌鞭毛A基因高度保守区,扩增产物为450bp。结果显示该方法仅在空肠和结肠弯曲菌DNA有扩增产物出现,最小检测量达... 为了解急性腹泻病人空肠和结肠弯曲菌的感染率,建立了空肠和结肠弯曲菌的PCR检测方法。引物设计在结肠弯曲菌鞭毛A基因高度保守区,扩增产物为450bp。结果显示该方法仅在空肠和结肠弯曲菌DNA有扩增产物出现,最小检测量达50fgDNA,而其它细菌如幽门弯曲菌,亲水气单胞菌,豚鼠气单胞菌,副溶血弧菌和产肠毒素性大肠埃希菌均未见扩增产物。检测急性腹泻患者粪便100份,11例为阳性。 展开更多
关键词 聚合酶链反应 空肠弯曲菌 结肠弯曲菌 核酸
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气肿疽梭菌鞭毛基因克隆载体的构建 被引量:8
8
作者 张皓 田金华 +4 位作者 朴明淑 齐强 刘昕昕 李扬 金鑫 《延边大学农学学报》 2015年第2期91-95,共5页
根据GenBank中发表的气肿疽鞭毛蛋白的结构基因FliA(C)的序列,从中截取抗原表位部分基因序列,设计合成1对引物,引物的5`和3`端分别加入了BamHⅠ和XhoⅠ2个酶切位点。通过降落PCR法扩增合成长度为429bp的目的基因片段。将PCR产物克隆于pM... 根据GenBank中发表的气肿疽鞭毛蛋白的结构基因FliA(C)的序列,从中截取抗原表位部分基因序列,设计合成1对引物,引物的5`和3`端分别加入了BamHⅠ和XhoⅠ2个酶切位点。通过降落PCR法扩增合成长度为429bp的目的基因片段。将PCR产物克隆于pMD18-T simple载体,之后将其转入大肠杆菌DH 5α感受态细胞筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD18-T-FliA(C)并进行PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定。结果表明:扩增的目的基因与GenBank登录的ATCC10092菌株序列同源性为99%,4个碱基不同,仅有1个氨基酸不同。测出的基因序列发表于GenBank,登录号为KF712490。试验证明用降落PCR方法能方便、快速、准确的获得目的基因片段。本试验成功构建了重组克隆载体pMD18-T-FliA(C),为气肿疽鞭毛蛋白的表达载体构建及鞭毛蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 气肿疽鞭毛蛋白基因 降落PCR 重组质粒 基因克隆
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转鞭毛蛋白基因水稻细菌性条斑病抗性研究 被引量:1
9
作者 王晓宇 陈志谊 +3 位作者 刘文真 罗楚平 张荣胜 周华飞 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期1534-1539,共6页
该研究从生防菌枯草芽胞杆菌Bs-916中克隆了鞭毛蛋白基因,利用转基因载体pCAMBIA1300转入水稻,筛选得到98株阳性转基因植株。分子检测结果表明,有12个转基因株系可检测到目的基因的表达。随后抗病性鉴定表明,有3个转基因株系对水稻细菌... 该研究从生防菌枯草芽胞杆菌Bs-916中克隆了鞭毛蛋白基因,利用转基因载体pCAMBIA1300转入水稻,筛选得到98株阳性转基因植株。分子检测结果表明,有12个转基因株系可检测到目的基因的表达。随后抗病性鉴定表明,有3个转基因株系对水稻细菌性条斑病具有较高的抗性。该研究为目前水稻抗细菌性条斑病转基因研究拓宽了可应用基因资源的范围。 展开更多
关键词 鞭毛蛋白基因 水稻细菌性条斑病 水稻 枯草芽胞杆菌
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问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白与外膜蛋白基因融合DNA疫苗载体的构建 被引量:1
10
作者 王敏 戴保民 +2 位作者 游自立 方之茂 王雅静 《华西医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期169-171,共3页
目的 为增强问号赖型钩端螺旋体 (钩体 0 17株 ) DNA疫苗内鞭毛蛋白基因 (fla B2 )与外膜抗原基因 (omp L1 )的免疫保护作用 ,构建一种能表达 fla B2 与 om p L1 蛋白融合蛋白的 DNA疫苗载体。方法 通过聚合酶链反应分别扩增 0 17钩体... 目的 为增强问号赖型钩端螺旋体 (钩体 0 17株 ) DNA疫苗内鞭毛蛋白基因 (fla B2 )与外膜抗原基因 (omp L1 )的免疫保护作用 ,构建一种能表达 fla B2 与 om p L1 蛋白融合蛋白的 DNA疫苗载体。方法 通过聚合酶链反应分别扩增 0 17钩体 fla B2 与 omp L1 片段并进行融合 ,获得的嵌合基因 om p L1 - fla B2 中含有 10个氨其酸的中间接头序列 ,以维持其空间构象。结果 经酶切鉴定 ,证实有一 1.8kb片段插入载体 ,其 fla B2 及 om p L1 DNA测序结果与文献报道的一致。结论 表达 0 17株钩体 fla B2 与 om p L1 抗原融合蛋白的 展开更多
关键词 外膜蛋白 基因融合 DNA疫苗 载体 构建 问号赖型钩端螺旋体 内鞭毛蛋白
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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌flic基因的克隆表达及生物信息学分析 被引量:1
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作者 李任峰 田香勤 +4 位作者 何启盖 王自良 赵坤 李学斌 王三虎 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2009年第10期25-30,共6页
【目的】构建猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actionobacillus pleuropneumoniae,App)鞭毛蛋白(flic)编码基因的重组表达质粒,对其编码蛋白进行生物信息学分析,并将其在原核细胞中进行表达。【方法】利用PCR方法扩增flic基因片段,将其克隆至p... 【目的】构建猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actionobacillus pleuropneumoniae,App)鞭毛蛋白(flic)编码基因的重组表达质粒,对其编码蛋白进行生物信息学分析,并将其在原核细胞中进行表达。【方法】利用PCR方法扩增flic基因片段,将其克隆至pMD-18T载体后测序,利用生物信息学软件对其编码蛋白的二级结构及跨膜区进行预测。构建重组表达质粒pGEX-flic,转化大肠杆菌工程菌BL21,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE及Western-blo对表达蛋白进行鉴定。【结果】获得的目的基因片段长度为528 bp,测序表明其序列与GenBank公布的一致;软件预测结果显示,该蛋白具有多个明显的二级结构成分及跨膜区;SDS-PAGE检测表明,在约50 ku处有一特异性条带;Western-blot检测表明,表达蛋白具有良好的抗原活性。【结论】成功获得了App的flic基因,其编码的蛋白质具有较多的α螺旋区和无规则卷曲区域,表达的鞭毛蛋白具有生物学活性。 展开更多
关键词 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 flic基因 鞭毛蛋白 生物信息学
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福建省食品中分离的空肠弯曲菌株鞭毛蛋白基因flaA的PCR-RFLP分型 被引量:1
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作者 杨毓环 洪锦春 +1 位作者 叶玲清 张巧姬 《中国卫生检验杂志》 CAS 2008年第10期1965-1967,共3页
目的:采用PCR-RFLP基因分型方法对分离自福建省不同地区不同种类食品中的空肠弯曲菌株的鞭毛蛋白基因flaA进行分型,掌握福建省食品中空肠弯曲菌的基因型别,为流行病学追踪调查提供科学依据。方法:采用欧洲弯曲菌实验室网络Campynet推荐... 目的:采用PCR-RFLP基因分型方法对分离自福建省不同地区不同种类食品中的空肠弯曲菌株的鞭毛蛋白基因flaA进行分型,掌握福建省食品中空肠弯曲菌的基因型别,为流行病学追踪调查提供科学依据。方法:采用欧洲弯曲菌实验室网络Campynet推荐的空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA的PCR-RFLP分型方法(http://Campynet.vetinst.dk/Fla.htm)。即用PCR技术对弯曲菌的鞭毛蛋白基因flaA上的一个1700 bp片段进行扩增,再用限制性内切酶DdeI对PCR产物进行酶切,通过凝胶电泳并分析酶切图谱。结果:目前福建省食品中分离的空肠弯曲菌基因型别较多样,34株空肠弯曲菌可分为18个型别。不同地区分离的菌株其基因型多不相同,只有4个型别在不同地区的菌株间有重复。结论:空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA的PCR-RFLP分型方法分辨率高,可重复性好,不需要特殊设备,且操作简单、快速,适合于实验室开展,且方法标准化后,能将世界各地获得的数据进行比较,从而能更好的了解各个基因型的区域分布和流行趋势。 展开更多
关键词 空肠弯曲菌 鞭毛蛋白基因flaA PCR-RFLP分型
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伯氏疏螺旋体鞭毛基因的克隆及序列分析 被引量:1
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作者 仝彩玲 李培英 徐前明 《畜牧与兽医》 北大核心 2010年第3期20-22,共3页
根据已有的伯氏疏螺旋体鞭毛基因序列,设计两条特异性引物,PCR扩增该基因,并获得基因全长序列,大小为1 008 bp。采用生物信息学技术,对所获得的伯氏疏螺旋体鞭毛基因序列和拟编码的蛋白序列进行分析,发现其编码336个氨基酸,编码蛋白的... 根据已有的伯氏疏螺旋体鞭毛基因序列,设计两条特异性引物,PCR扩增该基因,并获得基因全长序列,大小为1 008 bp。采用生物信息学技术,对所获得的伯氏疏螺旋体鞭毛基因序列和拟编码的蛋白序列进行分析,发现其编码336个氨基酸,编码蛋白的理论分子量为35.7 ku,等电点为5.53,具有多个抗原表位序列,其中编码主要抗原位点的片段位于中央区段,该中央区段还具有伯氏疏螺旋体种的保守性。伯氏疏螺旋体鞭毛基因中央区段编码蛋白既是主要的抗原位点又具有保守性,理论上可作为莱姆病的诊断抗原。本文为莱姆病的实验室诊断奠定基础。 展开更多
关键词 伯氏疏螺旋体 鞭毛基因 序列分析
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5种克罗诺杆菌鞭毛蛋白fliC基因的克隆和序列分析
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作者 姜华 徐湾 +4 位作者 张逸飞 邹小倩 裴尚飞 赵珉生 李远宏 《江苏师范大学学报(自然科学版)》 CAS 2015年第1期80-83,共4页
根据C.sakazakii BAA 894全基因组序列中fliC基因(Gene ID:CP000783.1),设计特异性引物,通过PCR方法扩增了5种克罗诺杆菌fliC基因的全长序列,并通过生物信息学方法对fliC基因进行了序列分析.序列分析结果表明:fliC基因的全长为837bp... 根据C.sakazakii BAA 894全基因组序列中fliC基因(Gene ID:CP000783.1),设计特异性引物,通过PCR方法扩增了5种克罗诺杆菌fliC基因的全长序列,并通过生物信息学方法对fliC基因进行了序列分析.序列分析结果表明:fliC基因的全长为837bp,编码279个氨基酸.同源性分析表明:5种克罗诺杆菌fliC基因的序列相似性为92.11%~99.40%;与其它细菌的fliC序列进行比较,其核酸序列同源性为51.73%~82.57%.这表明克罗诺杆菌fliC基因具有较高的保守性,可作为制备克罗诺杆菌多克隆抗体或单克隆抗体的一种候选抗原. 展开更多
关键词 克罗诺杆菌 鞭毛蛋白fliC基因 序列分析
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桑青枯雷尔氏菌鞭毛蛋白flic基因的克隆和序列分析
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作者 杨金宏 陈冰洁 +1 位作者 程煜 孔卫青 《湖南农业科学》 2013年第6期4-5,8,共3页
以桑青枯雷尔氏菌MR111为材料,对MR111的鞭毛蛋白基因flic的部分序列进行了PCR扩增和测序。结果表明:获得了flic基因400 bp的序列,序列编码蛋白有典型的鞭毛蛋白N-末端的螺旋区。NCBI在线BLAST分析表明,该序列与其他青枯雷尔氏菌菌株的... 以桑青枯雷尔氏菌MR111为材料,对MR111的鞭毛蛋白基因flic的部分序列进行了PCR扩增和测序。结果表明:获得了flic基因400 bp的序列,序列编码蛋白有典型的鞭毛蛋白N-末端的螺旋区。NCBI在线BLAST分析表明,该序列与其他青枯雷尔氏菌菌株的鞭毛蛋白基因的同源性在97%以上。 展开更多
关键词 青枯雷尔氏菌 鞭毛蛋白基因 克隆 序列分析
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延边株气肿疽梭菌鞭毛蛋白FliA基因克隆及生物信息学分析 被引量:4
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作者 张永佳 张皓 +1 位作者 李成辉 金鑫 《延边大学农学学报》 2017年第2期35-40,59,共7页
根据气肿疽鞭毛基因(GenBank登录号:AB058932)的参考序列,PCR扩增并克隆延边株气肿疽梭菌鞭毛蛋白FliA基因。成功克隆后测序,并采用生物信息学方法对鞭毛蛋白FliA基因的蛋白质二级结构、结构功能域、三级结构及抗原表位等重要参数进行... 根据气肿疽鞭毛基因(GenBank登录号:AB058932)的参考序列,PCR扩增并克隆延边株气肿疽梭菌鞭毛蛋白FliA基因。成功克隆后测序,并采用生物信息学方法对鞭毛蛋白FliA基因的蛋白质二级结构、结构功能域、三级结构及抗原表位等重要参数进行了预测和分析。结果表明:与AB058932序列相比,存在38处突变,核苷酸序列的同源性和氨基酸序列的同源性均为97%;FliA蛋白的理论等电点为6.99,不存在跨膜区和信号肽序列,二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,主要有15个潜在B细胞抗原表位区,17个限制性CTL抗原表位区。本试验为延边株气肿疽FliA蛋白功能的深入研究奠定了基础。 展开更多
关键词 气肿疽梭菌 延边株 FliA基因 克隆 生物信息学分析
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大肠杆菌鞭毛蛋白不同结构域与F4菌毛主要结构亚单位FaeG嵌合基因的构建及其表达蛋白的功能研究 被引量:2
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作者 吴文文 庞胜美 +4 位作者 丁雪燕 刘思国 王晓钧 段强德 朱国强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期656-661,共6页
为探究大肠杆菌鞭毛蛋白不同结构域与其免疫佐剂活性的相关性,本研究通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)分别构建了出血性大肠杆菌EDL933(O157􀏑H7)鞭毛蛋白FliCH7基因的全长(aa1~aa585)、N端保守区(aa1~aa174)、N端加中间的高变区(a... 为探究大肠杆菌鞭毛蛋白不同结构域与其免疫佐剂活性的相关性,本研究通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)分别构建了出血性大肠杆菌EDL933(O157􀏑H7)鞭毛蛋白FliCH7基因的全长(aa1~aa585)、N端保守区(aa1~aa174)、N端加中间的高变区(aa1~aa496)与产肠毒素大肠杆菌F4ac+国内标准株C83902(O8􀏑K88􀏑H19)主要亚单位FaeG串联表达的嵌合基因,即FliC-FaeG、FliCN-FaeG和FliCNV-FaeG,分别将其克隆至pET-28a(+)表达载体中经IPTG诱导表达;经SDS-PAGE和western blot分别对表达的融合蛋白进行鉴定。PCR结果显示3个嵌合基因分别约为2600 bp、1300 bp和2300 bp;SDS-PAGE结果显示融合蛋白的大小分别约为:90 ku、48 ku和80 ku,均与预期大小一致。Western blot结果表明3种融合蛋白均能被抗FaeG的单克隆抗体识别;表明融合蛋白中FaeG仍维持其独立的结构和生物学活性。抗FliCH7的抗体可识别FliC-FaeG和FliCNV-FaeG融合蛋白,而FliCN-FaeG融合蛋白不含鞭毛蛋白高变区,所以不能被识别;TLR5受体活性检测结果表明,仅FliC-FaeG融合蛋白能激活TLR5受体,引起IL-8、TNF-α炎性因子的分泌,以上结果表明TLR5受体活性的激活需要完整的鞭毛蛋白结构,本研究以FaeG为模型抗原,构建了大肠杆菌鞭毛蛋白不同结构域与其相结合的融合蛋白,为进一步研究大肠杆菌鞭毛蛋白不同结构域免疫佐剂活性的差异性和深入研究鞭毛蛋白发挥其免疫佐剂活性的机理提供了参考依据。 展开更多
关键词 鞭毛蛋白 结构域 免疫佐剂 嵌合基因
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气肿疽延边株FliA基因真核表达载体的构建 被引量:2
18
作者 张永佳 张皓 +1 位作者 李成辉 金鑫 《延边大学农学学报》 2017年第3期50-54,共5页
为构建气肿疽延边株FliA基因的真核表达载体PVAX1-FliA,根据Genbank气肿疽鞭毛基因(登录号:AB058932)的参考序列,利用Primer 5.0设计1对引物,通过PCR扩增出完整的气肿疽延边株FliA基因。将目的基因与pMD-19T载体连接转化到大肠杆菌DH5α... 为构建气肿疽延边株FliA基因的真核表达载体PVAX1-FliA,根据Genbank气肿疽鞭毛基因(登录号:AB058932)的参考序列,利用Primer 5.0设计1对引物,通过PCR扩增出完整的气肿疽延边株FliA基因。将目的基因与pMD-19T载体连接转化到大肠杆菌DH5α,进行测序、PCR、双酶切鉴定阳性克隆质粒。用回收后的基因与真核表达载体PVAX-1连接,并经双酶切、测序鉴定。本试验成功构建了鞭毛基因的重组真核表达载体PVAX1-FliA,为探讨气肿疽延边株FliA基因的分子生物学特性和功能及免疫新途径提供依据。 展开更多
关键词 气肿疽延边株 FliA基因 真核表达载体 构建
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嗜水气单胞菌fla基因重组植物乳杆菌的构建及其表达产物的免疫原性分析 被引量:1
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作者 魏俊锋 于华波 +3 位作者 王红 李晓彤 单晓枫 张冬星 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第15期109-114,共6页
为了检测嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)鞭毛(flagellum,fla)基因在重组植物乳杆菌中表达产物的免疫原性,试验将目的基因fla与表达载体pPG结合,通过电击法将其转至植物乳杆菌感受态细胞中,构建重组植物乳杆菌Lp-pPG-fla,通过Wester... 为了检测嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)鞭毛(flagellum,fla)基因在重组植物乳杆菌中表达产物的免疫原性,试验将目的基因fla与表达载体pPG结合,通过电击法将其转至植物乳杆菌感受态细胞中,构建重组植物乳杆菌Lp-pPG-fla,通过Western-blot检测重组植物乳杆菌fla蛋白的表达情况。将120尾鲫鱼随机分为Lp-pPG-fla组、Lp-pPG组和PBS组,各组分别连续口服Lp-pPGfla、Lp-pPG和PBS 28 d,分别在0(免疫前)及开始免疫后第7,14,21,28天时采集血清,通过ELISA试剂盒检测血清中免疫球蛋白(Ig)M的含量,溶菌酶(LYS)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性。在第29天(口服结束后第1天)进行免疫保护性试验,观察2周并记录死亡情况,计算免疫保护率。结果表明:成功构建了重组植物乳杆菌Lp-pPG-fla,获得的fla蛋白条带大小为38 ku。免疫后Lp-pPG-fla组鲫鱼血清中IgM含量在7,14,21,28天极显著高于其他两组(P<0.01),Lp-pPG组和PBS组之间差异不显著(P>0.05);LYS活性在14,21,28天极显著高于其他两组(P<0.01),Lp-pPG组和PBS组之间差异不显著(P>0.05);AKP活性在7,14,21,28天极显著高于其他两组(P<0.01),Lp-pPG组和PBS组之间差异不显著(P>0.05);SOD活性在14,21,28天极显著高于其他两组(P<0.01),在第7天时显著高于其他两组(P<0.05),LP-PPG组和PBS组之间差异不显著(P>0.05)。对鲫鱼攻毒后,Lp-pPG-fla组的免疫保护率达到60%,远高于对照组。说明用重组植物乳杆菌免疫鲫鱼可以提高其免疫能力。 展开更多
关键词 嗜水气单胞菌 鞭毛蛋白 基因重组 重组植物乳杆菌 免疫原性
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基于鞭毛蛋白基因的坚强芽孢杆菌特异性套式PCR和荧光定量PCR方法的建立
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作者 许彦芬 王海亮 +2 位作者 陈大菾 宋晓玲 黄倢 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2015年第3期68-73,共6页
细菌鞭毛蛋白编码基因hag具两端的保守序列及中间可变区域,在细菌的分类和鉴定中可作为分子标记。本研究克隆了坚强芽孢杆菌鞭毛蛋白编码基因hag部分序列,根据所得核酸序列设计套式引物Bfho和Bfhi,进行菌株的套式PCR特异性检测。此外,... 细菌鞭毛蛋白编码基因hag具两端的保守序列及中间可变区域,在细菌的分类和鉴定中可作为分子标记。本研究克隆了坚强芽孢杆菌鞭毛蛋白编码基因hag部分序列,根据所得核酸序列设计套式引物Bfho和Bfhi,进行菌株的套式PCR特异性检测。此外,采用内引物Bfhi建立坚强芽孢杆菌荧光定量PCR特异性检测方法并确定该方法的检测限,对15个模拟样品进行检测并对阳性组中坚强芽孢杆菌的含量进行定量分析。结果显示,克隆得到的坚强芽孢杆菌hag基因长为1213 bp,经比对,与枯草芽孢杆菌hag基因相似性为13%-15%。荧光定量PCR方法对坚强芽孢杆菌菌株PC004和PC024的检测限分别为17.3×103和19.7×103 CFU/ml。模拟样品检测结果显示,15个样品中检测出7个阳性,并同时定量各样品中坚强芽孢杆菌的含量。本研究建立的坚强芽孢杆菌检测方法特异性强、操作时间短、灵敏度高,可为该菌的实际检测提供技术支持。 展开更多
关键词 坚强芽孢杆菌 鞭毛蛋白 hag基因 套式PCR 荧光定量PCR
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