深海太平洋火色杆菌琼胶降解基因分析和琼胶酶Aga0950的表达及酶学性质

【目的】对深海太平洋火色杆菌(Flammeovirga pacifica WPAGA1)全基因组进行生物信息学分析,筛选获得琼胶酶基因aga0950,采用基因工程手段对该基因的功能和性质进行验证和分析。【方法】采用Illumina HiSeq2500测序技术进行基因组测序分析;采用克隆表达和镍柱纯化方法获得纯aga0950基因表达产物;采用薄层层析(TLC)和离子色谱(IC)法分析酶降解琼胶产物;采用二硝基水杨酸法(DNS)测定琼胶酶活性。【结果】基因组序列分析表明,菌株WPAGA1全基因组拥有13个β-琼胶酶相关基因;氨基酸序列比对显示,同源性为60%–85%,其中aga0950是具有GH16家族典型特征的基因,同源性为67%。纯化的重组酶Aga0950比活力达51770 U/mg,具有高效降解琼胶活性,降解终产物为新琼四糖和新琼六糖;最适温度为50°C,最适pH为4.0–10.0;Co^(2+)、Mn^(2+)和Fe3+促进酶活,Cu^(2+)抑制酶活。【结论】深海菌株WPAGA1具有丰富的琼胶酶基因;属于GH16家族的琼胶酶基因aga0950表达产物具有高效降解胶琼活性和良好的热、酸、碱稳定性。

深海太平洋火色杆菌琼胶酶Aga2660的克隆表达及发酵优化

【背景】琼胶寡糖已成为化妆品、食品、医药等领域的研究热点,而生物酶法被认为是制备琼胶寡糖的高效方法。【目的】从深海太平洋火色杆菌(Flammeovirga pacifica WPAGA1)筛选获得琼胶酶基因aga2660,对基因aga2660进行克隆转化,使其在大肠杆菌中进行表达,分析重组酶的性质以及酶解产物。【方法】采用克隆表达和镍柱纯化方法获得aga2660基因表达的纯化产物;采用薄层层析和离子色谱法分析酶解产物;5L发酵罐采用补料阶段指数流加、诱导阶段乳糖连续流加的策略进行产酶发酵条件的优化。【结果】基因aga2660是具有GH50家族典型特征的基因,酶解产物为单一的新琼二糖。最适温度为30°C,最适pH为7.0,Mn^(2+)、Ca^(2+)和Mg^(2+)能促进琼胶酶Aga2660的酶活。采用发酵优化策略后的酶活达到11.81U/mL,比优化前提高了13.2倍。【结论】琼胶酶Aga2660具有良好的热、酸、碱稳定性,其酶解产物为单一的新琼二糖,这为特定聚合度琼胶寡糖的制备奠定了良好基础。