金针菇中具抑瘤活性的碱性蛋白火菇素的分离纯化和性质研究(英文)

目的 对一种具有抑瘤活性的碱性蛋白火菇素进行分离纯化和性质研究。方法 应用硫酸铵、乙醇分级沉淀 ,柱色谱等方法进行分离纯化。电泳分析、氨基酸组成分析、质谱分析等方法被用于火菇素的理化性质研究。结果 火菇素被提纯至电泳纯并结晶。经性质研究确定火菇素的分子量为 19891.13Da ,pI=8.9,λmax=2 76～ 2 78nm ,λmin=2 5 0nm ,并缺少甲硫氨酸。通过基质辅助激光解吸离子化质谱 (MALDI—MS)分析 ,测得了火菇素的指纹图谱 ,表明它为一种新蛋白。结论 火菇素被首次提纯至电泳纯 。

火菇素蛋白的免疫印迹检测

从金针菇子实体浸提液中提取了抗癌活性物质火菇素 ,将纯化的火菇素用Freund佐剂乳化后注射到新西兰白兔体内 ,经数次加强免疫后采血并分离了抗血清 ,并以抗血清为探针建立了火菇素蛋白的免疫印迹法定性检测方法。应用免疫学方法检测金针菇菌丝体和子实体 ,结果显示 ,只在金针菇子实体中发现与火菇素抗体相结合的抗原信号。

金针菇生物活性物质结构与功能的研究进展

金针菇Flammulina velutipes含有多种生物活性物质,具有很高的药用价值。总结了近年来金针菇中火菇素(flammulin)、溶细胞素(flammutoxin)、免疫调节蛋白(Fip-fve)、抗病毒蛋白、跨上皮电抗性蛋白(TEER-TDP)和金针菇多糖(FVP)的研究进展。

火菇素cDNA的初步免疫学筛选

火菇素是一种具有抗癌活性的简单蛋白 ,从金针菇中分离纯化火菇素的方法如下 :金针菇子实体经乙酸液浸提、硫酸铵和乙醇分级沉淀后 ,通过DEAE SephadexA 5 0除去色素和部分杂蛋白 ,最后经CM SephadexC 5 0离子交换柱层析分离 ,得到了电泳均一的纯化蛋白 .以火菇素为抗原制备的抗血清为探针对构建的金针菇cDNA表达文库进行免疫印记筛选 ,对获得的阳性克隆进行PCR、酶切以及在大肠杆菌中诱导表达等初步鉴定 ,为进一步确证、克隆火菇素基因打下了基础 .

金针菇菌丝体的深层培养及多糖制取

从２０株金针菇菌株中筛选出适于液体发酵的９４Ｂ２株。该菌种适宜的摇瓶培养条件：培养温度２３～２４℃，ｐＨ６．５，接液体种量１０％，装液量≤５０ｍｌ／５００ｍｌ瓶；不同的间歇振荡形式对菌丝球产量和形态有显著影响。深层发酵工艺相似于抗生素发酵。发酵期间发酵液ｐＨ变化幅度很小，总糖、还原糖、氨基氮与菌丝生长量有一定的相关性。发酵酵的菌丝产量可达４７．５ｇ（湿重）／１００ｍｌ、胞外多糖达１７４．７ｋｇ／１００ｍｌ发酵液上清、胞内多糖达３３８．１ｍｇ／１００ｇ湿菌丝体。

火菇素的溶液二级结构与变性动力学

为了弄清抗肿瘤活性物质火菇素蛋白的二级结构及其活性在保存时自然衰减的规律 ,为临床应用提供依据 ,测定了火菇素的圆二色性并用蛋白质二级结构解析程序分析了火菇素的溶液二级结构 ,研究了火菇素的变性动力学 .火菇素的远紫外圆二色性的研究表明 ,其水溶液在 2 0 8nm处表现为大负峰 ,最大平均残基摩尔椭圆度 [θ]2 0 8=- 6574deg·cm2·dmol-1,在 2 2 3nm处为肩 .经二级结构解析程序计算分析 ,火菇素的二级结构组成为 :α螺旋 1 5.2 % ,平行 β折叠片和 β转角6.1 % ,反平行 β折叠片 32 .7% ,无规卷曲和 γ转角 2 3.4% ,其中二硫键和芳香氨基酸对火菇素圆二色性的贡献占 2 2 .6% .热变性几乎使所有的二级结构都遭到破坏 ,转化为无规卷曲 .利用已建立的火菇素免疫单向琼脂扩散定量检测技术 ,对在 4℃下保存的火菇素进行了长期跟踪检测 ,结果表明 ,在保存过程中火菇素的活性逐步降低 ,同时其二级结构也被破坏 .根据实验结果 ,建立了火菇素变性的一级动力学方程模型 :ct=coe-t/τ,该模型方程能很好地拟合实验结果 .根据模型方程计算的火菇素的寿命为 370 d,半衰期为 2 56d.说明火菇素这种很有应用前景的抗肿瘤药物比较容易长期保存 .

火菇素抗体探针的制备与高灵敏度的火菇素定性技术的建立

从金针菇子实体浸提液中提取了抗癌活性物质火菇素 ,将纯化的火菇素用Freund佐剂乳化后注射到新西兰白兔体内 ,经数次加强免疫后采血并分离了抗血清 ,应用免疫学方法检测与硝酸纤维素滤膜上抗原蛋白相结合的抗体探针 ,检测极限可达 2 0 - 4

火菇素纯化流程的改进

利用前文建立的火菇素免疫单向琼脂扩散定量检测技术 ,对火菇素纯化流程作了定量监测 ,针对一、二、三等金针菇原料的不同特点 ,对纯化技术作了相应改进 ,可分别使火菇素的提取率提高 71 .3% ,1 87.6%和 2 1 7.9% ,1Kg风干子实体的火菇素产量达到 1 0 9.1mg ,52 .3mg和 2 7 0mg .