肠炎沙门菌fliC蛋白的表达及ELISA检测方法的建立

为了给临床检测肠炎沙门菌提供一种切实可行的血清学方法,本研究根据肠炎沙门菌(SE)鞭毛蛋白基因(fliC)序列设计一对引物,利用PCR扩增出fliC基因大小为285bp,克隆到表达载体pGEX-4T-1中,成功构建重组质粒pGEX-4T-fliC。将重组质粒pGEX-fliC转化大肠埃希菌DH5诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,表达的水溶性重组蛋白大小为37ku,有较好的反应原性。以重组蛋白GST-fliC为包被抗原建立间接ELISA检测肠炎沙门菌抗体的方法,为肠炎沙门菌的检测提供一种敏感度高、特异性强的检测方法。

FliC蛋白R91S突变对肠炎沙门菌鞭毛形态和小鼠体内定植的影响

沙门菌血清D群3个血清型FliC蛋白氨基酸序列比对分析表明肠炎沙门菌与鸡伤寒沙门菌完全相同,二者与鸡白痢沙门菌存在第91位氨基酸位点差异。本研究旨在探究肠炎沙门菌FliC蛋白第91位精氨酸突变对鞭毛形态、细菌运动性和小鼠体内定植能力的影响。运用λ-Red同源重组技术删除肠炎沙门菌CICC10467 fliC基因,构建系列反式回补突变株,通过体外生长特性试验和Western blot试验分析各菌株生长和FliC蛋白表达情况,运动性试验分析各菌株在半固体琼脂中的泳动能力,电子显微镜观察各菌株鞭毛形态,细胞感染试验分析各菌株的细胞黏附和入侵能力,动物感染试验分析各菌株的组织侵染能力。结果表明,fliC基因缺失株及点突变回补株与野生株的体外生长能力无显著差异(P≥0.05)。fliC基因缺失后肠炎沙门菌不表达鞭毛蛋白,各点突变回补株与野生株鞭毛蛋白表达量无明显差异。FliC蛋白R91S突变导致肠炎沙门菌鞭毛形态由超螺旋形态转变为钝直、柔韧度减弱,运动性显著降低(P<0.0001),对RAW264.7和HCT116细胞的黏附入侵能力显著下降(P<0.001),对BALB/c小鼠的器官侵染能力显著减弱(P<0.001)。综上表明,FliC蛋白第91位精氨酸对维持细菌运动性至关重要,第91位精氨酸突变能够显著改变肠炎沙门菌鞭毛形态,减弱肠炎沙门菌在小鼠体内定植能力。

鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

利用PCR扩增出鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因fliC,连接到原核表达载体pET28a(+)上,测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,构建了原核表达系统。经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导及Ni-NTA纯化后,得到了带6×His纯化标签的分子质量大小约为54.6kD的表达产物,和预测蛋白大小一致,且大部分表达产物以可溶形式存在利用Western-blotting进一步鉴定,结果表明,该蛋白能与抗His标签的单抗发生特异性反应。用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,获得多克隆抗体,并对抗血清的效价和特异性进行检测,结果表明,多抗的效价较高,特异性较好。

类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FliC与EHEC O157∶H7 EspA蛋白的融合表达及其免疫学性质研究

目的融合表达类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FilC与肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157 EspA蛋白,并评价其免疫学性质。方法 PCR扩增类鼻疽杆菌FilC编码基因bpsl3319,连接到基于EHEC O157 EspA的表达载体pEspA上,表达并纯化EspA-FliC融合蛋白,Western blot分析其抗原性;EspA-FliC免疫Balb/c小鼠评价其免疫原性。结果获得了bpsl3319目的基因,构建了重组表达质粒pEspA-bpsl3319;实现了EspA-FilC的高效表达,其表达量约占菌体总蛋白的25%,纯化后蛋白纯度超过85%。Westernblot结果显示EspA-FliC能分别与抗类鼻疽杆菌多克隆抗体、抗EHEC O157∶H7 EspA的单抗和多抗血清发生特异性抗原抗体反应。EspA-FilC免疫Balb/c小鼠可刺激其产生高效价特异的IgG,且此抗体能识别EspA-FilC、EspA以及天然类鼻疽杆菌的FliC。结论重组表达了融合蛋白EspA-FilC,该蛋白具有较好的免疫反应性和良好的免疫原性。此研究为下一步研制类鼻疽杆菌和EHEC O157的二联疫苗奠定了基础。

5种克罗诺杆菌鞭毛蛋白fliC基因的克隆和序列分析

根据C.sakazakii BAA 894全基因组序列中fliC基因（Gene ID：CP000783.1）,设计特异性引物,通过PCR方法扩增了5种克罗诺杆菌fliC基因的全长序列,并通过生物信息学方法对fliC基因进行了序列分析.序列分析结果表明：fliC基因的全长为837bp,编码279个氨基酸.同源性分析表明：5种克罗诺杆菌fliC基因的序列相似性为92.11%～99.40%;与其它细菌的fliC序列进行比较,其核酸序列同源性为51.73%～82.57%.这表明克罗诺杆菌fliC基因具有较高的保守性,可作为制备克罗诺杆菌多克隆抗体或单克隆抗体的一种候选抗原.

胞内劳森菌鞭毛素蛋白FliC与猪肠上皮细胞互作蛋白的研究

为鉴定胞内劳森菌鞭毛蛋白FliC与猪肠上皮细胞中的互作蛋白,本研究利用PCR方法从回肠炎疫苗提取的DNA中扩增胞内劳森菌鞭毛素基因LI0710,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中构建重组质粒pET32aLI0710,经双酶切及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导并经SDS-PAGE检测。结果显示,获得可溶且与硫氧还蛋白-6×His-S标签(Trx-His-S)融合表达的重组FliC蛋白(Trx-His-S-FliC)。采用镍柱亲和层析法纯化Trx-His-S和Trx-His-S-FliC,并分别与猪肠上皮细胞(IPEC-J2)裂解液孵育后,利用anti-His抗体进行免疫共沉淀试验(Co-IP),并对沉淀物利用液质联用串联质谱(LC/MS/MS)技术分析与FliC互作的宿主蛋白,利用Proteome Discoverer 1.4软件在UniProtKB/Swiss-Prot数据库中对互作的宿主蛋白进行肽指纹图谱分析。Co-IP结果显示,检测到了多个与Trx-His-S-FliC互作的宿主蛋白,且通过LC/MS/MS技术共鉴定到50个与FliC互作的蛋白。这些互作蛋白包括蛋白酶、多个核糖体蛋白和线粒体蛋白,广泛参与了细胞质糖酵解、氨基酸代谢、ATP跨膜转运等功能。为了证明质谱数据的可靠性,选择与FliC互作最强的胰蛋白酶经western blot验证,结果显示,胰蛋白酶与FliC蛋白确实存在互作,表明质谱数据可靠。本研究首次鉴定到多个与胞内劳森菌鞭毛蛋白FliC互作的宿主蛋白,为研究FliC蛋白的功能奠定了基础。

肠炎沙门氏菌FliC单克隆抗体阻断ELISA检测方法的建立及初步应用

为建立肠炎沙门氏菌(SE)血清学检测方法,本研究原核表达了SE的FliC蛋白高变区,经SDSPAGE和western blot鉴定分析,结果显示,原核表达的His-FliC和GST-FliC重组蛋白分别约为52 ku和70 ku,能够与SE阳性鸭血清特异性反应。GST-FliC重组蛋白经纯化后免疫BALB/c小鼠(150μg/只),经细胞融合、克隆和筛选获得1株阳性杂交瘤细胞,命名为1D3。Western blot结果显示MAb 1D3可以特异性识别g,m型沙门氏菌鞭毛。以MAb 1D3为阻断抗体建立阻断ELISA(bELISA)方法,经条件优化后确定His-FliC重组蛋白包被浓度为4μg/mL,MAb 1D3稀释倍数为1:16000,包被条件为4℃12 h,封闭液为5%脱脂乳;利用该方法检测239份阴性鸭血清计算阻断率为30.46%(cut-off值)。采用该bELISA方法检测SE、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、阿培依姆沙门氏菌、大肠杆菌、阿尼蒂斯葡萄球菌、鸭疫里默氏杆菌的阳性血清,结果显示,除SE阳性血清外,该方法与其余病原阳性血清均不发生交叉反应,特异性强;利用本研究建立的bELISA方法与IDEXX试剂盒检测不同稀释倍数的SE阳性血清,结果显示,两种方法最低检测稀释倍数均能够达到1:320,敏感性较高;重复性试验结果显示,b ELISA方法的批内和批间变异系数均小于10%,重复性好。利用本实验建立的bELISA与IDEXX公司试剂盒对105份鸡血清样品和3个鸭场的48份鸭血清样品检测,结果显示,与IDEXX试剂盒比较,本实验建立的bELISA方法特异性为98.97%、敏感性91.07%,二者符合率为96.30%。利用本实验建立的bELISA方法和微量试管凝集试验(MAT)分别检测人工感染北京鸭血清抗体,两种方法结果均显示107cfu/只和106cfu/只SE感染7日龄的北京雏鸭后4 d~6 d产生抗体应答,两周后抗体效价达到峰值;109cfu/只感染14周龄北京鸭,感染后5 d抗体阳性率达到80%,感染后11 d平均抗体效价达到1:120。本研究首次利用SE FliC蛋白制备MAb建立了阻断ELISA方法,该方法具有特异性好、敏感性高、特异性强的特点,能够快速有效检测SE感染的禽血清抗体,为禽SE的流行病学调查提供技术手段。

Flic对低剪切力所致动脉粥样硬化的影响

目的探讨Flic蛋白作为免疫调节剂对低剪切力所致动脉粥样硬化的影响及机制。方法雄性新西兰大耳白兔18只随机分为3组:对照组(Con组,n=6)、低剪切力组(LSS组,n=6)、低剪切力+Flic蛋白组(Flic组,n=6),通过颈动脉套管法建立低剪切力致动脉粥样硬化模型。应用彩色多普勒超声检测颈动脉血管狭窄程度及阻力指数RI值,HE染色评价斑块面积,ELISA方法检测血浆IFN-γ及IL-4水平。结果与Con组比较,Flic组和LSS组动脉血管狭窄程度、阻力指数RI值及斑块面积均明显增加(P<0.05);与LSS组比较,Flic组动脉血管狭窄程度及阻力指数RI值明显降低(P<0.05),斑块面积明显缩小(P<0.05)。与Con组比较,Flic组和LSS组血清IFN-γ水平明显升高(P<0.05),IL-4水平明显降低(P<0.05),IFN-γ/IL-4比值升高(P<0.05);与LSS组比较,Flic组IFN-γ水平明显降低(P<0.05),IL-4水平明显升高(P<0.05),IFN-γ/IL-4比值明显降低(P<0.05)。结论Flic蛋白能够减轻低剪切力所致动脉粥样硬化,其机制可能为调节Th1/Th2平衡。

马流产沙门菌鞭毛重组蛋白FliC的原核表达及对小鼠的免疫保护试验

为研究马流产沙门菌新疆分离株鞭毛蛋白FliC(flagellin C)的免疫生物学特性及保护特性。本研究利用PCR技术扩增获得该菌的Fli C基因,并将其连接到原核表达载体p ET-28a(+)上,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,用IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE和Western-blot检测与分析表达蛋白,并将纯化的重组蛋白免疫小鼠。结果显示,成功诱导表达了52 ku的重组蛋白,该蛋白第2次免疫小鼠第14天时血清中的特异性Ig G抗体效价可达1∶72 900,且抗体亚型以Ig G1为主,免疫小鼠的攻击保护率可达73%。结果表明,Fli C重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护效果。为进一步开展马流产沙门菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。

马流产沙门菌重组鞭毛蛋白FliC和FljB免疫原性比较

为评价与比较马流产沙门菌(Salmonella abortus equi)2种不同鞭毛蛋白FliC(Flagellin C)和FljB(Flagellin B)的免疫原性,为进一步利用这两种蛋白奠定实验基础,本研究诱导表达及纯化FliC和FljB蛋白,将纯化后的蛋白分别免疫小鼠,对免疫后小鼠的抗体水平、滴度及抗体亚型进行检测,攻击小鼠后进行免疫相关受体检测及病理组织学观察。结果显示,成功诱导表达了重组蛋白FliC和FljB,纯化后蛋白的相对分子量分别为52 kDa和42 kDa。两种蛋白分别免疫小鼠,产生较高水平的特异性抗体IgG,FljB免疫组抗体水平高于FliC免疫组,且抗体亚型以IgG1为主。FljB免疫组攻击保护率为87.5%,高于FliC免疫组的75%,病理组织学及脏器荷菌数检测结果显示,FljB免疫组效果优于FliC免疫组;FljB免疫组诱导TLR2、TLR4、MHC-I、TCR(T细胞抗原受体)的水平均高于FliC免疫组。该结果表明,FljB免疫组诱导小鼠免疫应答的水平高于FliC免疫组。

致犊牛脑炎大肠杆菌Flic3和FimD蛋白的生物信息学分析及克隆表达

为了对致犊牛脑炎大肠杆菌S9922的Flic3、FimD蛋白进行生物信息学分析,并进行诱导表达,试验利用在线分析软件对Flic3、FimD蛋白进行生物信息学分析,利用PCR技术扩增Flic3和FimD基因,构建重组质粒pET32a-Flic3和pET32a-FimD,转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态进行原核表达,并进行SDS-PAGE分析和Western-blot检测。结果表明:Flic3蛋白的原子组成为C_(1381)H_(2284)N_(412)O_(496)S_(5),理论等电点为5.08,含有2个糖基化位点,α-螺旋、β-转角、β-片层和无规则卷曲分别占48.24%、6.39%、18.85%、26.52%,有13个可能的抗原表位。FimD蛋白的原子组成为C_(1828)H_(2798)N_(510)O_(588)S_(9),理论等电点为6.16,含有8个糖基化位点,α-螺旋、β-转角、β-片层和无规则卷曲分别占6.54%、5.50%、32.94%、56.02%,有15个潜在的抗原表位。Flic3和FimD蛋白都是亲水、稳定蛋白,都不含跨膜区和信号肽。SDS-PAGE分析结果显示,重组蛋白Flic3大小为51 ku,重组蛋白FimD大小为59 ku,皆以包涵体形式表达。Western-blot检测后目的条带与预期一致,具有良好的免疫原性。说明Flic3和FimD蛋白原核表达成功,可用于制备致犊牛脑炎大肠杆菌疫苗。