应用Ca^(2+)荧光探针fluo-3和fluo-4测定H_2O_2诱导的A549细胞凋亡过程中的[Ca^(2+)]_i变化

背景与目的肺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤,Ca2+对于肿瘤细胞凋亡有重要的调控作用。实时监测肺癌细胞内Ca2+水平,有助于深入研究Ca2+介导肺癌细胞凋亡的分子机制。本研究旨在观察Ca2+荧光探针fluo-3和fluo-4在H2O2诱导的A549细胞凋亡过程中的应用,实时测定胞浆Ca2+浓度([Ca2+]i),探讨[Ca2+]i与细胞凋亡的关系,并比较两种Ca2+探针在荧光强度及[Ca2+]i测定值方面的差异。方法采用Ca2+荧光探针fluo-3和fluo-4负载细胞,1 h后用不同浓度的H2O2刺激细胞,激光扫描共聚焦显微镜实时测定选取细胞的[Ca2+]i变化。采用DAPI染色试剂盒观察H2O2刺激后细胞凋亡情况。结果在相同的探针浓度、负载时间和相同的图像采集参数的条件下,选定细胞内fluo-4平均荧光强度高于fluo-3。50 mM H2O2刺激后,A549细胞胞浆内[Ca2+]i迅速升高,通过公式计算发现采用fluo-3探针负载的选定细胞中[Ca2+]i变化范围是112.2 nM-1,069.6 nM,采用fluo-4探针负载的选定细胞中[Ca2+]i变化范围是7.6nM-505.4 nM。同时发现经H2O2刺激后,凋亡细胞百分比明显增加(P<0.01)。结论 H2O2促进A549细胞内Ca2+释放,诱导细胞凋亡。Ca2+探针fluo-4可能更适合于监测含量较低的细胞中[Ca2+]i变化。

钙敏荧光试剂Fluo－2的合成

Ｆｌｕｏ－２是一种具有大共轭体系的新型荧光试剂，由于吨酮基的引人，其Ｅｘ，Ｅｍ值分别为４９３ｎｍ及５１８ｎｍ，可用于普通荧光光度计进行［Ｃａ￣（２＋）］＿ｉ测定。本文报道了它的全合成，特别是采用在活泼的苯环上引人溴原子，与锂交换后再与吨酮缩合形成碳一碳键的方法。

荧光指示剂孵育法测定小麦叶肉细胞原生质体胞质游离Ca^(2+)的变化

研究以孵育法将Ca2+荧光探针Fluo-3AM载入小麦叶肉细胞原生质体胞质中,并结合激光共聚焦扫描显微技术,建立了测定原生质体胞质游离Ca2+动态变化的试验方法。

双色流式细胞术在检测特定亚群淋巴细胞Ca^(2+)变化中的应用

目的 :建立检测特定亚群淋巴细胞内钙离子的方法 .方法 :以PHA刺激 96h的PBMC作为研究对象 ,在以quantum red标记的抗膜表面抗原CD8进行膜表面染色的同时 ,进行Fluo 3/AM负载及细胞内Ca2 + 的检测 ,摸索以双色流式细胞术检测特定亚群淋巴细胞内Ca2 + 变化的最佳条件 .并检测经钙离子载体A2 31 87和趋化性细胞因子刺激后 ,PHA活化的PBMC中CD8+ 细胞内的Ca2 + 变化 .结果 :①选择 1μmol/L作为Fluo 3/AM负载的最佳浓度 ;②与Fluo 3/AM负载相适应的改良染色条件不影响膜表面荧光染色的阳性率和平均荧光强度 ;③趋化性细胞因子刺激后 ,CD8+ 细胞内Ca2 +浓度有一定水平上调 ,但远不如A2 31 87的作用明显 .结论 :建立了以双色流式细胞术鉴定特定亚群淋巴细胞内钙离子变化的方法 ,可广泛用于不同淋巴细胞亚群钙离子的快速精确测量 .

川芎与天麻的不同配伍对体外培养大鼠皮层神经元正常和缺氧状态下[Ca^(2+)]i的影响

目的 遵循传统医学的药物配伍理论 ,研究川芎与天麻不同配伍对正常及缺氧情况下神经元胞浆 [Ca2 + ]i的影响 ,寻找中药配伍和创新中药的理论基础。方法 采用体外培养 4～ 6d的大鼠皮层神经元 ,分为生理盐水空白对照 ,95 %乙醇本底对照 ,尼莫地平阳性对照 ,实验组 (1～ 5号药对 ,川芎与天麻的比例分别为 4∶1、1∶4、4∶0、0∶4、1∶1 ,各药对分别配制成 5 0、1 0 0、1 5 0 μg·ml 1 3个浓度 ) ,再分为两部分 ,一部分持续通入 94 .5 %N2 和 5 .5 %CO2 的混合气体 4h制备缺氧模型 ,一部分在正常状态下孵育 4h ,以特异性荧光探针Fluo - 3为胞浆内Ca2 + 指示剂负载神经元 ,用激光扫描共聚焦显微镜动态监测药对对神经元胞浆 [Ca2 + ]的影响。结果 缺氧 4h后神经元胞浆内 [Ca2 + ]较缺氧前明显增加 ,川芎的醇提部分、川芎与天麻以 1∶4配伍作用时 ,较小剂量 (5 0 μg·ml-1 )对正常及缺氧时的神经元均有降低胞浆 [Ca2 + ]的作用 (P <0 .0 5 ) ,川芎的醇提部分 1 0 0 μg·ml-1 作用明显减轻缺氧神经元钙超载的同时不影响正常情况下神经元胞浆内外的钙离子平衡 ,与此同时其它川芎与天麻的配伍或只降低正常情况下的胞浆 [Ca2 + ],或无作用 ,或在大剂量时出现反转作用。

芥子碱对PC12细胞内游离钙升高的影响

目的:考察芥子碱对高钾除极和谷氨酸引起细胞外钙内流以及咖啡因和环匹阿尼酸(cyclopia-zonic acid,CPA)引起细胞内钙释放所导致的PC12细胞内游离钙升高的影响。方法:PC12细胞用终浓度为5μmo.lL-1的钙离子荧光指示剂Fluo-3/AM于37℃避光负载孵育。细胞内游离钙([Ca2+]i)用VictorⅡ1420多功能标记分析仪检测,以荧光强度(FI)表示。结果:当有外钙存在时,PC12细胞静息[Ca2+]i的FI值为(1 188±163),75 mmol.L-1KCl和10 mmol.L-1谷氨酸引起细胞外钙内流,使[Ca2+]i增高,FI峰值分别增至(4 270±982)和(3 096±402)。芥子碱(0.01,0.1,1.0,10,100μmol.L-1)对静息[Ca2+]i没有明显的影响,但浓度相关性地抑制高钾和谷氨酸诱发的[Ca2+]i增高,抑制率分别为10.2%,39.5%,53.7%,71.8%,88.4%和30.3%,55.7%,68.5%,79.2%,94.1%。当无外钙存在时,PC12细胞静息[Ca2+]i的FI值为(813±112)。咖啡因(40 mmol.L-1)和CPA(30μmol.L-1)分别引起Caffeine-ryanodine和三磷酸肌醇(InsP3)敏感型-钙池释放而使[Ca2+]i升高,FI值分别增至(2 944±371)和(1 844±332)。芥子碱(0.1,1.0,10,100μmol.L-1)浓度相关性地抑制咖啡因和CPA诱发的[Ca2+]i增高,抑制率分别为23.7%,61.9%,77.5%,88.2%和10.9%,23.8%,44.6%,68.3%。结论:芥子碱能显著抑制电压依赖性和受体依赖性钙通道开放所引起的外钙内流,且对受体依赖性钙通道的抑制作用更强。此外,芥子碱对Caffeine-ryan-odine受体和InsP3敏感型钙池的内钙释放也有明显抑制作用,且对Caffeine-ryanodine受体敏感型钙池的抑制作用更强。这提示芥子碱有望成为很有研发前景的新型钙阻滞剂。

腺苷对缺氧时海马神经元内游离Ca^(2+)的影响

实验用Fluo-3负载细胞，在激光扫描共聚焦显微镜下直接监测缺氧后分散培养的大鼠海马CA1区神经元内游离Ca2+浓度（［Ca2+］i）的变化，观察腺苷对这种变化的影响并初步探讨其作用机制。结果发现，急性缺氧使海马神经元［Ca2+］i显著升高；腺苷（100μmol/L）明显抑制缺氧引起的［Ca2+］i增高，腺苷A1受体拮抗剂CPT以及K+通道阻断剂4-AP和ATP敏感性K+通道阻断glipizide均可拮抗腺苷的抑制作用。结果表明，腺苷通过其A1受体介导，可能激活4-AP和／或ATP敏感性K+通道，从而抑制缺氧引起的海马神经元胞内Ca2+升高。

低强度He-Ne激光照射对离体小鼠巨噬细胞Ca^(2+)浓度的影响

为研究低强度Ｈｅ－Ｎｅ激光照射对离体小鼠巨噬细胞内Ｃａ２＋浓度的影响以及其与能量密度（剂量）的关系，用Ｆｌｕｏ－３乙酰甲脂对巨噬细胞Ｃａ２＋作荧光标记，应用图象分析系统检测激光照射后细胞内Ｃａ２＋的荧光强度变化。结果：Ｈｅ－Ｎｅ激光照射引起细胞内Ｃａ２＋浓度改变。照射５ｍｉｎ，激光剂量为０．６７９Ｊ／ｃｍ２，细胞荧光强度出现非常明显的增强；照射１０ｍｉｎ，剂量为１．３５８Ｊ／ｃｍ２，细胞荧光强度增强达到最大值；照射１５ｍｉｎ，剂量为２．０３７Ｊ／ｃｍ２，细胞荧光强度减弱；照射２０ｍｉｎ，剂量为２．７１６Ｊ／ｃｍ２，细胞荧光强度降低至对照组之下。低强度Ｈｅ－Ｎｅ激光照射巨噬细胞可引起细胞内Ｃａ２＋浓度上升，产生细胞内信号传递，进而控制细胞功能。

新荧光试剂3－对甲苯基－5－（2’－羧基苯偶氮）绕丹宁的合成及荧光光度法测定蚕丝制品中痕量铜的研究

本文报道了新荧光试剂３－对甲苯基－５－（２’－羧基苯偶氨）绕丹宁（ＰＭ－ＰＲＡＣＰ）的合成。用元素分析、红外光谱、核磁共振氢谱和质谱确证了其结构，研究了其荧光性质。在ｐＨ５．６时，该试剂与Ｃｕ￣（２＋）形成稳定的荧光螯合物，且在λ＿（ｅｘ）／λ＿（ｅｍ）＝３０５ｎｍ／４０５ｎｍ产生强烈荧光。其荧光强度与Ｃｕ￣（２＋）的浓度在０～１．６μｇ／２５ｍＬ范围内呈线性关系，检测限为５×１０￣（－４）μｇ／ｇ。已用于痕量铜（Ⅱ）的荧光分光光度法测定。测定了蚕茧、蚕丝和丝绸中的痕量铜，结果满意。

单细胞内Ca^（2＋）时空变化的激光共聚焦显微测定

应用激光扫描共聚焦显微系统（ＬＳＣＭ）和Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ荧光探剂标记技术，测定了单个活细胞胞内游离Ｃａ２＋的动态变化与立体分布影像．结果显示，在３７℃，Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ终浓度为６μｍｏｌ／Ｌ的条件下，Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠巨噬细胞负载１ｈ左右即可获得良好的标记效果．相反，若探剂浓度太高或负载时间太长，胞内荧光强度太强，影响在共聚焦显微镜镜下分辨细胞内结构．因此用ＬＳＣＭ研究细胞内游离Ｃａ２＋变化时，荧光探剂的负载应以获得最适荧光信号而不是以最大荧光强度为标准．上述方法在其他如平滑肌细胞、卵母细胞中的测定亦获得满意的结果，这对进一步研究各种生理和病理条件下细胞内Ｃａ２＋信号的动态变化、与跨膜Ｃａ２＋梯差的关系及对活细胞功能活动的调节提供了一种可行的、直观的研究手段。

曲妥珠单抗联合奥沙利铂、5-氟尿嘧啶治疗HER-2/neu高表达晚期胃癌的临床疗效观察

目的观察曲妥珠单抗联合奥沙利铂、5-氟尿嘧啶治疗HER-2/neu高表达晚期胃癌的临床疗效与安全性。方法选择2009年10月—2011年4月收治的晚期胃癌患者84例为研究对象,随机分为观察组(44例)与对照组(40例),对照组给予奥沙利铂联合5-氟尿嘧啶化疗方案,观察组在此基础上加用曲妥珠单抗,2组均化疗4个周期,并进行24个月随访观察,对比2组化疗结束后临床疗效、化疗期间药物毒性反应及24个月内存活情况。结果(1)2组化疗结束后1个月,观察组总体有效率为63.6%,KPS评分为(79.6±6.4)分,均高于对照组的42.5%和(75.8±5.7)分,HER-2细胞外定量(28.4±6.6)μg/L低于对照组的(31.5±7.2)μg/L,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)观察组心脏毒性、发热或寒战、皮疹发生率显著高于对照组(分别为15.9%vs 2.5%、25.0%vs 10.0%、29.5%vs 7.5%),差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)观察组化疗结束后24个月平均生存率为(43.5±7.1)%,平均存活时间为(16.9±3.1)个月,均高于对照组的(39.7±5.8)%和(14.6±2.8)个月,差异有统计学意义(P<0.05)。结论对HER-2/neu高表达晚期胃癌患者在行奥沙利铂联合5-氟尿嘧啶化疗基础上使用曲妥珠单抗,能明显提高临床疗效,延长患者存活时间;同时需密切监测曲妥珠单抗的药物毒性尤其是心脏毒性。

多非替利衍生物CPU228(V03)对大鼠心室肌细胞钙瞬变的调节

目的 :在β 受体激动情况下 ,研究多非替利衍生物CPU 2 2 8对电刺激触发心肌细胞的胞浆Ca2 + 浓度([Ca2 + ]i)变化及钙瞬变动力学参数的影响。方法 :游离单个大鼠心室肌细胞 ,Fluo 3 AM负载 ,电刺激诱发心室肌细胞钙瞬变 ,定量测定心室肌细胞内Ca2 +浓度变化 ,异丙肾上腺素 (isoproterenol,ISO) 10 0nmol·L-1激动β 受体 ,观察CPU 2 2 81μmol·L-1对钙瞬变动力学参数、[Ca2 + ]i 及钙负荷水平的影响。结果 :CPU2 2 81μmol·L-1对大鼠心室肌细胞 [Ca2 + ]i 的影响不明显 (P >0 .0 5 ) ;ISO 10 0nmol·L-1显著升高大鼠心室肌细胞 [Ca2 + ]i 和细胞内钙负荷水平 ,缩短钙瞬变时程 ,并且增加钙瞬变的消除速率。CPU 2 2 81μmol·L-1显著抑制ISO的上述作用。结论 :在β 受体激动情况下 ,CPU 2 2 8可以降低心肌细胞 [Ca2 + ]i,使ISO改变的钙瞬变动力学参数恢复到正常水平。

基于三(2-羧乙基)异氰尿酸酯与稀土金属的配合物合成、晶体结构及性质

以合成新颖结构的荧光材料为目标,基于三(2-羧乙基)异氰尿酸酯(简称H_3tci)基础单元与稀土金属,在水热170℃条件下合成了一系列新颖的具有相同构型的配位聚合物,即{[Ln(tci)(H_2O)_2]·2H_2O}_n(Ln=Dy(1)、Eu(2)、Gd(3)、La(4)、Nd(5)、Sm(6)).通过X射线单晶衍射仪、FTIR、PXRD、TGA、荧光等,对聚合物的结构及性能进行了表征.结构分析表明:配合物为二维平面结构,在氢键作用下形成了三维网状结构,热稳定性能好,且配合物1、2、5、6具有良好的荧光性能.

烟草悬浮细胞在凋亡过程中Ca^(2+)分布的共聚焦显微成像研究

以Fluo-3AM为游离Ca^(2+)荧光探针,利用激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)对烟草悬浮细胞在热激诱导的凋亡过程中Ca^(2+)时空分布进行了研究。结果显示,在正常细胞中,Ca^(2+)集中分布在细胞壁和细胞核中,细胞质中分布较少;在凋亡早期细胞中,细胞质中Ca^(2+)的浓度增加;在凋亡晚期的细胞中,细胞核中的Ca^(2+)浓度增加较为明显。结果提示,在凋亡过程中,Ca^(2+)的定位分布存在一定的规律。

用Fluo3-AM测定2型糖尿病患者淋巴细胞内Ca^(2+)浓度及药物对患者胞内Ca^(2+)浓度的影响

用 Fluo 3- AM为荧光探针 ,测定 2型糖尿病患者淋巴细胞内 Ca2 +浓度 ,观察了肾上腺素、多巴酚丁胺、Bay K 864 4、胰岛素等药物对胞内 Ca2 +的作用机制。实验表明患者胞浆内 Ca2 +浓度与正常人相比显著升高 ;药物对胞内 Ca2 +的刺激表明 ,病人对外界钙激动剂更敏感。胰岛素能刺激胞内 Ca2 +浓度升高 ,其作用机制是激活钙离子通道。肾上腺素不仅能激活钙离子通道 ,也能促使钙从钙池中释放。上述研究也表明 Fluo- 3是有效的研究胞内 Ca2 +变化的荧光探针。 2型糖尿病的发生可能与 Ca2 +浓度升高有关 。

2,3-二羟喹喔啉的合成及其在微量铅分析中的应用

合成了新荧光试剂2.3-二羟喹喔啉(DHQX),并研究了Pb(Ⅱ)对它的荧光熄灭作用,建立了荧光熄灭法测定食醋中的微量Pb(Ⅱ),检出线性范围为0～75pg/25mL,结果满意。

荧光猝灭法研究2,6-二(邻甲基苯亚甲基)环己酮与牛血清白蛋白的相互作用

应用荧光光谱研究了2,6-二(邻甲基苯亚甲基)环己酮(用A表示)与牛血清白蛋白(BSA)间的结合作用,确定了A对BSA的荧光猝灭过程的猝灭机理.测定了不同温度下该结合反应的结合常数,结合位点数,热力学参数.结果表明A与BSA以1∶1的比例结合形成复合物,结合过程主要是熵驱动,相互作用主要为疏水作用力.

一种可工业化的2-溴-5-氟三氟甲苯的制备方法

以邻三氟甲基苯胺为原料,经桑德迈尔反应溴代、硝化、加氢还原,最后再重氮化氟代合成2-溴-5-氟三氟甲苯,总收率70%;该方法原料廉价易得,所涉及到的反应都是工业上较成熟的反应,可工业化生产。

氯化钾除极对分离的豚鼠心室肌细胞胞浆内[Ca^(2+)]_i的影响

用酶解法分离单个豚鼠心室肌细胞，以荧光探针Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ标记胞浆内游离钙离子，用激光扫描共聚焦显微镜实时测定胞浆内［Ｃａ２＋］ｉ变化。分别观察了在正常台氏液和无钙台氏液中３０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ除极对胞浆内［Ｃａ２＋］ｉ的影响。结果表明，在正常台氏液中，３０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ除极可引起胞浆内［Ｃａ２＋］ｉ持续升高，持续时间超过２５０ｓ；在无钙台氏液中，３０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ除极可引起胞浆内［Ｃａ２＋］ｉ短暂升高，持续时间约１００ｓ。由此可见，在豚鼠心室肌细胞上，ＫＣｌ除极可引起胞内钙贮库的钙释放，而且这种钙释放不需要钙内流的介导。胞浆内［Ｃａ２＋］ｉ的持续性升高需要外钙内流来维持。

5-羟色胺对培养胃底平滑肌细胞内游离钙动员的影响

目的 研究 5 - HT诱导胃底平滑肌细胞内钙动员的机制 .方法 采用 Ca2 +指示剂 Fluo- 3/ AM作为细胞内钙离子的荧光探针负载培养的胃底平滑肌细胞 ,共聚焦技术检测细胞内钙荧光强度的变化 .结果 基础状态下 SFSMC[Ca2 + ]i 荧光强度 (FI)为 2 6 4± 15 ,5 - HT 10μmol· L- 1 使荧光强度的变化 ΔFI为 16 .5± 2 .6 ;细胞外无钙时 ,5 - HT升高[Ca2 + ]作用被减弱 ,但除去细胞外钙 ,并使用内罗啶 (ryan-odine)孵育后 ,5 - HT 不再引起荧光强度的变化 ;10μmol· L- 1 米安舍林 (mianserin)可部分拮抗 5 - HT升高[Ca2 + ]i 的作用 ,赛更定 (cyprohetadine)不能抑制 5 - HT升高的胞内钙 ;Mn92 0 2和拉西地平 (lacidipine)均能完全抑制 5 -HT升高 [Ca2 + ]i 的作用 .结论 5 - HT可通过促进外钙内流及钙池 (SR)释放使 [Ca2 + ]i 升高 ;在胃底平滑肌 5 - HT升高胞内钙部分通过 5 - HT2 受体 ,而不是通过 5 - HT1 C受体 ;5 -羟色胺通过 L型钙通道促外钙内流 ;二氢吡啶类钙拮抗剂能通过阻滞 L 型钙通道 ,而完全抑制 5 -