狂犬病病毒Flury株(LEP)在乳鼠脑内及BHK-21细胞上的传代固定及生物学特性测定

将狂犬病病毒Flury株(LEP)通过乳鼠脑和BHK-21细胞系交叉传代10代,并对交叉传代获得的各代毒种进行对细胞的适应性、病毒含量、毒力的测定。结果表明:病毒经乳鼠脑内传代后,能很好的在BHK-21细胞上增殖,各代次病毒含量均在10-6.0TCID50/0.1 mL以上,平均达到10-6.75TCID50/0.1 mL;对3～5日龄乳鼠平均LD50达到10-5.5/0.03 mL,对11～13g小鼠平均LD50达到10-4.6/0.03 mL;毒力试验证明,交叉传代的细胞毒对犬和家兔无致病性。

微载体培养BHK-21细胞生产狂犬病毒Flury株的研究

本文主要研究了利用生物反应器Tide-Cell微载体培养的BHK-21细胞生产狂犬病毒Flury株工艺。总数为1×1010个BHK-21细胞接入装有500 g BioNOCTMⅡ型载体的Tide-Cell培养系统,最适条件下培养120 h。当细胞培养系统中葡萄糖消耗量达到8 g/(L·h)左右,细胞数达到4×1011时,按照MOI为1接入Flury株病毒。一批至少可以收获10次(50 L/次)毒价高于107.5TCID50/mL的抗原液,其中包含5次毒价为108.0TCID50/mL的抗原液。提高抗原液病毒含量有助于提升狂犬病灭活疫苗效价,从而降低生产成本。

狂犬病病毒P基因的原核表达及间接ELISA方法的应用

目的以狂犬病病毒P蛋白作为检测抗原,用间接ELISA方法检测狂犬病病毒抗体。方法根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)LEP-Flury株的基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出P基因的全长序列,克隆于pGM-T载体中,获得重组质粒pGM-T-P,将重组质粒用限制性内切酶NotI和EcoRI进行双酶切,酶切产物定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核重组表达质粒pET-32a-P,阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot分析确定蛋白表达量和特异性。用纯化的蛋白作为诊断抗原,通过对反应条件的优化,初步将间接ELISA方法应用于狂犬病病毒抗体的检测中。结果扩增RV P基因,构建了克隆质粒pGM-T-P、原核表达质粒pET-32a-P,高效表达了主要以可溶性形式存在的P蛋白,并能与RV阳性血清发生特异性反应。用表达的狂犬病病毒重组P蛋白建立了用于RV抗体检测的间接ELISA方法。结论成功表达了磷蛋白,用其作为固化抗原以间接ELISA方法检测RV抗体。