脊髓肽MP-2的Fmoc法固相合成、HPLC纯化及其活性检测

目的:用固相法合成脊髓肽 MP-2并验证其生物活性。方法:采用 Fmoc 固相法对脊髓肽 MP-2进行仪器自动合成,通过正交实验对反应条件进行了优化,肽-树脂复合物酸裂解后获得小肽粗品。用高效液相色谱法对所得粗品纯化制备,并利用 LC-MS 色谱仪确定目标产物,最后对纯品的生物活性进行检测。结果:通过正交实验优化 PSSM-8多肽合成仪合成MP-2的反应条件,粗品得率达到82%,HPLC 峰归一化法检测纯度为62.9%,中压柱制备后纯品纯度达到96.7%。纯品对S180肿瘤细胞进行抑瘤试验,证明 MP-2 0.25 mg·kg^(-1)对 S180有明显抑制作用,抑瘤率50.4%,且毒性低,不影响动物的发育生长。结论:合成实验证明,Fmoc 固相合成法合成脊髓肽 MP-2,操作条件温和且粗品得率较高,质谱检定主峰为目标峰后中压柱进行制备,分离操作简单,可以进行小批量生产;活性试验证明 MP-2具有抑制肿瘤S180生长的效果,为进一步进行药效学验证提供了初探基础。

OPA/FMOC柱前衍生高效液相色谱法测定细胞培养基M199中氨基酸含量

目的:该实验建立了以OPA/FMOC作为柱前衍生化试剂,采用高效液相色谱法测定细胞培养基中氨基酸含量的方法。在10～180μg.mL-1范围内线性关系良好,相关系数在0.9953～1.000之间,平均回收率95.9%～102.4%,CV%<3.8%(n=5),重复性RSD为0.08%～3.82%(n=6)。结论:该方法准确、灵敏、简便快速,适用于细胞培养基中氨基酸的含量测定。

艾塞那肽主要有关物质的合成制备研究

艾塞那肽是一种用于治疗Ⅱ型糖尿病患者血糖的药物,艾塞那肽的有关物质包括工艺杂质和降解杂质,这些杂质的合成是以Rink树脂为载体,以HBTU/DIEA或HATU/HOBt·H2O/DIEA为缩合剂,乙酸酐封端,使用三氟乙酸(TFA)/苯甲硫醚(TA)/苯酚(Phenol)/乙二硫醇(EDT)体系脱除保护基和裂解得到粗肽;经RP-HPLC纯化后得到95%以上的样品,用LC-MS分析测定分子量确认杂质。

自组装多功能反应器固相合成依非巴特

采用集反应、搅拌、鼓泡、N2气保护和过滤五重功能的自组装反应器,研究了树脂种类、溶剂、缩合试剂和反应时间对环肽依非巴特产率的影响。结果表明,以Rink Amide AM树脂为固相载体,HBTU/HOBt/DIEA为肽键缩合剂,DMF为溶剂,反应2 h,粗肽得率高达86.6%,经液相色谱纯化后纯度达98%以上。

Eptifibatide的固相合成及分离纯化

Eptifibatide是一种血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂,临床研究结果显示其医用上的产业前景良好.采用Rink-Am-Resin树脂作为固相载体,Fmoc为保护策略固相合成了Eptifibatide.以DMF为反应溶剂,Piperidine-DMF脱去Fmoc保护基团,以TBTU/HOBt/DIEA作为肽键缩合试剂进行接肽反应,用TFA/EDT/TIS/H2O定量地从树脂上切除,制备型高效液相色谱分离纯化粗肽.同时对产品进行色谱分析和质谱鉴定.实验结果表明Fmoc合成策略中各步的缩合率均在95%以上,多数在99%以上.粗肽纯度为86.8%,产率为55%.分离纯化后的产物纯度达到98.5%,MOLDI-TOF质谱测得的m/z与理论值相符.为化学合成Eptifibatide及其分离纯化提供了一条切实可行的路线.

多肽固相合成的研究进展

多肽固相化学合成法是蛋白质研究领域非常重要的研究方法之一,主要可以分为Boc方法和Fmoc方法,在生物药物、蛋白质工程、免疫学等研究中得到了广泛的应用。该文论述了多肽固相合成法的原理,比较了两种典型合成方法的优缺点,介绍了适用于该方法的多肽种类,提出了多肽合成过程中存在的问题与解决策略,最后展望了多肽合成法的应用前景,以供相关领域的研究人员参考。

DCM和DMF对DCC-HOBt系统催化酯化及酰化反应的影响

DCC-HOBt系统在DCM和DMF溶剂中，催化Fmoc-Leu-OH与王氏树脂的酯化反应，其结合率分别为18％和10％．该系统催化Fmoc-Phe-OH与H2N-Leu-resin的酰化反应中，溶剂为DCM时，反应30min，其结合率为100％；当DCM：DMF体积比为1：3．5时，反应130min，其结合率为81％，表明DCC-HOBt系统宜在DCM非极性溶剂中催化肽键的形成．

甲状旁腺素1-34肽的固相合成

以Wang树脂为固相载体,改进Fmoc(芴甲氧羰基)/tBu法,采用HPLC二次纯化,合成了甲状旁腺素1-34肽,产率23.3%,纯度大于99%(HPLC)。

芴烯—哌啶加合物的紫外光谱研究及其应用

研究了芴烯—哌啶加合物的紫外光谱特性并将其应用于定量测定Fmoc锁定的树酯容量(capacity)和Fmoc保护的树酯肽含量。该法的灵敏度为0.000 1 mmol/g树酯。利用该法可在不损失树酯肽的情况下定量测定基于Fmoc的多肽固相合成法中各步反应的偶合产率。

酪氨酸四肽与ct-DNA的相互作用

采用Fmoc固相合成法合成了酪氨酸四肽(YYYY),经液相色谱-高效液相色谱(RP-HPLC)纯化,并用电喷雾质谱(ESI-MS)表征后,得到纯度大于90%的四肽,利用紫外光谱、圆二色光谱和荧光光谱研究了肽YYYY与ct-DNA的相互作用。结果表明,随着肽浓度的增加,ct-DNA的紫外吸收产生明显的增色效应,荧光猝灭显著,圆二色光谱发生红移。研究推测酪氨酸四肽以沟槽方式与ct-DNA发生相互作用,且酪氨酸四肽与ct-DNA的作用强于酪氨酸。

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG抗原肽的制备及免疫原性观察

目的制备髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）抗原肽,并观察其免疫原性。方法采用改进的Fmoc固相合成法制备MOG35~55抗原肽;以合成的MOG35~55抗原肽加完全弗氏佐剂（CFA）免疫C57BL/6小鼠,观察小鼠发病情况,并对小鼠脊髓和脑组织进行病理学检查。结果成功制备了MOG35~55抗原肽,精肽产率13.58%,纯度95%;MOG35~55抗原肽免疫后15 d起,小鼠开始陆续出现自身免疫性脑脊髓炎（EAE）临床症状,至第21天8只小鼠均发病,光镜下观察EAE小鼠脊髓和脑组织可见典型的炎性细胞浸润。结论采用改进的Fmoc固相合成法可制备具有良好免疫原性的MOG35~55抗原肽,用以制备C57BL/6小鼠EAE模型,发病率高,模型稳定。

五胜肽的合成研究

以丝氨酸Wang树脂为载体,HTBU和DIEA为缩合剂,通过采用Fmoc固相合成法,运用去保护、活化、偶联、切割等方法,合成了五胜肽粗品,多肽次序为Pal-Lys(Boc)-Thr(tbu)-Thr(tbu)-Lys(Boc)。经质谱成分鉴定分析,确定已经合成出五胜肽粗品。此合成方法具有操作简单,合成成本低、副反应少等优点,可用于一般短肽的合成。

降糖多肽CW7213的合成制备研究

CW7213是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物,具有多种生理功能:能够降低患者体重,更平稳地控制血糖水平,不会产生低血糖。该文主要对CW7213合成方法进行研究:以Fmoc-Gly-WANG树脂为起始原料,以HBTU、TBTU/HOBt为缩合剂,对长肽的合成方法和活性较低氨基酸的缩合方法进行优化。采用制备型反相高效液相色谱仪优化了CW7213的纯化方法。采用HPLC对产品进行了纯度分析,采用MS测定了其分子量。得到的CW7213纯度高达98.8%,总收率为21.3%。该方法简单易行,所得产品纯度和收率较高,能够满足CW7213药效学和毒理研究的需要。

新型促红细胞生成素衍生肽的制备

目的制备一种不具有促红细胞生成作用的新型促红细胞生成素(EPO)的衍生肽(DEPO)。方法 9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽合成法制备合成新型DEPO,质谱法检测鉴定DEPO相对分子质量,高效液相色谱法鉴定DEPO纯度。健康成年C57BL/6小鼠随机分为EPO(EPO 50μg·kg^(-1))组、DEPO低剂量(DEPO 50μg·kg^(-1))组、DEPO高剂量(DEPO 500μg·kg^(-1))组、生理盐水(生理盐水,0.2 m L)组和溶剂(ACN+Milliq,0.2 m L)组,隔日1次腹腔注射给药,各组于第3、7、14和30天取尾静脉血检测红细胞数变化,探究DEPO对促红细胞生成活性的影响。结果合成了一个新型、由37个氨基酸构成的DEPO,相对分子质量为3 814.8,纯度达95.25%。EPO组给药第3~30天红细胞数呈上升趋势,第14和30天较第3天显著增高(P<0.001)。DEPO低剂量组和DEPO高剂量组红细胞数未见明显增高。结论本研究合成了一种新型DEPO,其在体内不产生促红细胞生成的不良反应,具有一定的临床应用前景。