串联质谱技术联合基因检测在新生儿遗传代谢性疾病筛查诊断中的应用

本研究旨在探索串联质谱技术联合基因检测即高通量测序在新生儿遗传代谢性疾病筛查诊断中的应用。方法 本研究对80例新生儿进行了深入研究,其中男性占65%,女性占35%,平均年龄为2个月,平均出生体重为3.1kg。这些新生儿因为各种未明原因的症状如反复抽搐、电解质紊乱、多器官功能紊乱、胆汁淤积、黄疸持续不退、慢性腹泻和拒乳而受到关注。通过串联质谱技术对80例新生儿进行筛查,结果 表明其中5例为有机酸代谢病,5例为脂肪酸代谢病,14例为氨基酸代谢病,1例为尿素循环障碍,占比达到31.3%。结果 串联质谱技术筛查后结果显示,真阳性25例,真阴性35例,假阳性9例,假阴性11例,符合率75.0%;串联质谱技术筛查联合基因检测即高通量测序结果表明,真阳性36例,真阴性44例,假阳性和假阴性均为0,符合率达到100%,差异显著,P<0.05。结论 串联质谱技术联合基因检测在新生儿遗传代谢性疾病的筛查诊断中具有显著效果,其筛查诊断的准确性和符合率远超串联质谱技术筛查,将其应用于新生儿遗传代谢病的筛查诊断,能更早、更准确地诊断疾病,对疾病的早期发现、早期治疗以及预后评估有重要的临床意义。

基于串联质谱标签的蛋白质组学联合高内涵筛选技术筛选胃癌相关基因的研究

目的:应用Tandem mass tag(TMT)技术联合高内涵筛选(HCS)寻找潜在的胃癌相关基因。方法:利用TMT技术从胃癌及癌旁组织中筛选差异表达蛋白质,应用GO和KEGG数据库进行注释和信号通路富集并结合PubMed数据库结果,筛选出胃癌中未见或较少报道的上调目的基因。通过shRNA技术敲减基因,HCS技术比较敲减对细胞增殖的影响,筛选出肿瘤增殖相关基因并通过检测mRNA含量、克隆形成和CCK8进行验证。结果:通过TMT从胃癌和癌旁组织定量到差异表达蛋白1008个(上调649个,下调359个),25个目的基因敲减后HCS结果显示SF3B4敲减抑制细胞增殖,验证发现SF3B4是潜在的胃癌细胞增殖相关基因。结论:TMT技术结合HCS为肿瘤相关基因的筛选提供新的可能性。本研究提示SF3B4是潜在的胃癌增殖相关基因,为研究胃癌发生机制提供新线索。

基于16S rRNA和gyrB基因串联DNA特征序列的气单胞菌鉴定方法

【目的】建立基于16S rRNA序列和gyrB基因串联DNA特征序列的属内菌种鉴定方法,为气单胞菌的种间区分提供技术支持。【方法】以2020—2021年在我国福建、江苏等地分离获得的水产源气单胞菌和NCBI已公布且完成全基因组测序的10种气单胞菌为研究对象,分别以16S rRNA序列、gyrB基因及2个基因序列串联后得到的新DNA特征序列作为构建系统发育进化树的依据,比较不同系统发育进化树的鉴定结果,并以运动性试验、溶血性试验、糖发酵试验进行辅助鉴定。【结果】在基于16S rRNA序列构建的系统发育进化树中,中间气单胞菌、嗜水气单胞菌、达卡气单胞菌、肠源气单胞菌等聚类在不同分支上,未能形成独立的种属进化分支;在基于gyrB基因构建的系统发育进化树中,达卡气单胞菌、豚鼠气单胞菌和嗜水气单胞菌聚类在同一分支上,而异嗜糖气单胞菌和维氏气单胞菌聚类在另一分支上。将16S rRNA序列和gyrB基因串联组成新DNA特征序列再构建系统发育进化树建树,能完全有效分离气单胞菌属的不同菌株,将不同种的气单胞菌独立聚为一支,较好地实现种间区分。【结论】将16S rRNA序列和gyrB基因串联组成新DNA特征序列再构建系统发育进化树,较基于16S rRNA序列或gyrB基因单独构建系统发育进化树具有更高的分辨力,是一种理想的保守序列相似性高的属内菌种鉴定方法。因此,在16S rRNA测序鉴定为气单胞菌的情况下可再次以gyrB基因为测序对象,获得序列信息后与16S rRNA序列串联构建系统发育进化树,能更加精确地将气单胞菌鉴定到种水平。

高效液相色谱-串联质谱法测定磷酸西格列汀中基因毒性杂质乙二胺的含量

通过对甲苯磺酰氯对乙二胺进行衍生化,采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定磷酸西格列汀中基因毒性杂质乙二胺的含量。以Waters CORTECS®C18色谱柱为固定相,以不同体积比的5 mmol·L^(-1)乙酸铵-乙酸缓冲溶液(pH 5.6)和乙腈的混合溶液为流动相进行梯度洗脱。串联质谱分析中采用电喷雾离子源正离子(ESI+)模式,选择反应监测(SRM)模式。乙二胺的线性范围为0.50~33.5μg·L^(-1),检出限(3.3s/k)为0.55μg·L^(-1),以空白样品为基体进行加标回收试验,所得回收率为102%~103%。对平行配制的6份加标供试品溶液进行重复性和重现性试验,所得测定值的相对标准偏差均小于3.0%。

异戊酸血症患儿临床特征、基因型及随访分析

目的 探讨异戊酸血症(IVA)患儿临床特征、基因变异特点及随访结果,为该病的早期识别和诊断治疗提供依据。方法 回顾性分析2012年4月至2023年10月在儿内分泌遗传科明确诊断为IVA患儿的临床资料。结果 34例IVA患儿中,男22例、女12例。其中15例为急性新生儿型,3例为慢性间歇型,16例为来自新生儿筛查确诊的无症状型。与无症状型组相比,有临床症状组(包括急性新生儿型和慢性间歇型)血异戊酰肉碱(C5)水平,C5/乙酰肉碱(C2)比值及C5/丙酰肉碱(C3)比值以及尿中异戊酰甘氨酸水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。34例患儿IVD基因共检出40种基因变异类型,以错义突变为主(30/40, 75.0%),最常见的突变位点为c.1208A>G(n=8)。临床表现与基因变异类型未见明显相关性。随访死亡4例,均为急性新生儿型起病患儿。30例存活患儿最近1次随访时尿异戊酰甘氨酸水平显著下降,与治疗前相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 IVA患儿临床表现无明显特异性,血C5、C5/C2比值、C5/C3比值及尿异戊酰甘氨酸增高对诊断IVA具有特异性。新生儿筛查有助于该病的早期诊断、治疗及预后。

串联质谱技术筛查结合基因突变分析对赣州市PCD分布特点的研究

目的分析赣州市经串联质谱(MS/MS)技术筛查发现的原发性肉碱缺乏症(PCD)患者基因突变类型,为PCD的早期诊断和治疗提供依据。方法采用MS/MS技术对2018年1月至2021年12月赣南地区出生的新生儿进行PCD筛查,对筛查阳性的患者进行SLC22A5基因检测,收集所有经MS/MS技术筛查后确诊的35例PCD患者作为确诊组,18例携带基因患者作为携带组。分析确诊患者游离肉碱(FC)水平及基因检测结果。结果共筛查235644例新生儿,PCD确诊病例共35例,携带单基因突变18例,赣州市PCD总发病率为0.01%。确诊组FC水平为(5.26±1.99)μmol/L,携带组FC水平为(5.71±2.20)μmol/L,两组FC水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。35例PCD患者均经过基因检测确诊,共检测到15种SLC22A5变异体,最常见的变异体为c.51C>G(32.86%),其次为c.1400C>G(22.86%)和c.428C>T(11.43%);检测到的变异体聚集在外显子1占45.71%,聚集在外显子2占14.29%,聚集在外显子8占24.29%。不同性别SLC22A5基因突变类型分布情况比较,差异无统计学意义(χ^(2)=6.436,P>0.05);不同FC水平SLC22A5基因突变类型分布情况比较,差异有统计学意义(P<0.05);确诊病例纯合突变组与杂合突变组FC水平比较,差异有统计学意义(P<0.05);无义突变/错义突变组和错义突变/错义突变组FC水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论赣州市PCD发病率较高,MS/MS技术筛查对PCD早期诊断效果明显,对PCD突变基因类型分析可了解该地区PCD基因分布情况。PCD患者FC水平与基因突变类型可能相关,纯合突变患儿FC水平较杂合突变患儿低。

D18S51基因座引物结合区碱基突变导致等位基因丢失

目的分析DNA鉴定中D18S51基因座的等位基因丢失现象,探讨其对鉴定结果的影响。方法采用STR复合试剂盒检测,发现D18S51基因座的等位基因丢失,并对该等位基因进行测序分析。结果D18S51基因座丢失的等位基因在序列侧翼引物结合区发生突变,第8个碱基发生A突变为G,导致等位基因丢失的发生。结论在DNA鉴定中等位基因丢失易被误判为突变,需采用不同试剂盒检测验证,必要时加测其他遗传标记,避免累计亲权指数结果的错误。

超高效液相色谱-串联质谱法测定氯氮平中基因毒性杂质

目的建立超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS),测定氯氮平中基因毒性杂质。方法采用Inert Sil-ODS-3(75 mm×4.6 mm×3 mm)色谱柱;以0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相,流速为0.7 mL·min^(-1);质谱采用ESI负离子模式,进行多反应监测。结果通过外标法计算,邻氨基苯甲酸、环合物缩合物和环合物酸析物分别在20~100、0.16~3.2、0.48~3.2 ng·mL^(-1)范围内线性良好;低(80%)、中(100%)、高(120%)3个浓度的加样回收率为90.8%~117.2%,相对标准偏差(RSD)为3.9%~12.8%;检测限范围为0.08~10 ng·mL^(-1),邻氨基苯甲酸、环合物缩合物和环合物酸析物的定量限分别是20、0.16、0.48 ng·mL^(-1)。不同批次样品检测结果均低于限度值。结论本方法操作简便,结果可靠,适用于氯氮平中基因毒性杂质检测。

36个X-STR基因座在汉族人群中的遗传多态性荟萃分析

通过对选取的16篇文献中中国汉族群体的X-STR基因座相关参数(汉族群体来源包括广东、上海、云南、河南、北京、贵州、四川、海南、河北,检测试剂盒有Argus X12、Goldeneye 17X、AGCU X19、Microreader X19、Typer X19,等位基因频率大多基于百人份)进行荟萃分析,获取36个X-STR基因座(DXS6807、DXS9895、DXS10148、DXS10135、DXS8378、DXS9902、DXS6795、DXS6810、DXS10159、DXS10162、DXS10164、DXS7132、DXS10079、DXS10074、DXS10075、DXS981、DXS6800、DXS6803、DXS6809、DXS6789、DXS7424、DXS101、DXS7133、GATA172D05、GATA165B12、DXS10103、HPRTB、DXS10101、GATA31E08、DXS8377、DXS10134、DXS7423、DXS9907、DXS10146、DXS6797、DXS6804)在中国汉族人群中基于超1000个无关个体的等位基因频率,为涉及的X-STR亲缘关系鉴定似然率计算提供频率数据。通过荟萃分析发现16篇文献涉及汉族无关个体共8767人,36个X-STR基因座共572个等位基因,其中29个基因座的等位基因数目在基于超1000个无关个体计算后都有不同程度增加,DXS10135、DXS10134、DXS10148、DXS10079的等位基因数目增加均超5个。荟萃分析后获得的中国汉族群体36个X-STR基因座等位基因类型更齐全、等位基因频率更准确,可作为X-STR检验中计算亲缘关系似然率等参数的重要参考。

阿斯巴甜和糖精的基因毒性体外测试研究

目的探究两种常用甜味剂阿斯巴甜和糖精的基因毒性。方法采用液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术和高内涵筛选(high content screening,HCS)技术检测阿斯巴甜和糖精暴露后细胞中与DNA损伤修复途径相关的重要生物标志物,即γ-H2AX、p-H3、Rad51和p53的表达水平,并考察其量效和时效关系。结果LC-MS/MS检测结果表明阿斯巴甜和糖精在考察浓度下均不会引起细胞γ-H2AX和p-H3表达增加,即未呈现染色体断裂和纺锤体毒性;HCS检测结果显示糖精对4种生物标志物均无影响,阿斯巴甜对p53、γ-H2AX和p-H3这3种DNA损伤生物标志物无明显影响,但引起DNA同源重组修复(homologous recombination repair,HRR)蛋白Rad51呈现无剂量依赖性的显著增加。结论本研究表明阿斯巴甜和糖精经两种基因毒性体外测试方法检测,均未呈现显著DNA损伤基因毒性。

六例肉碱棕榈酰基转移酶2缺乏症患儿临床特征及基因变异分析

目的:探讨肉碱棕榈酰基转移酶2(CPT2)缺乏症患儿的临床表型及基因变异特点。方法:回顾性分析6例CPT2缺乏症患儿的临床和基因检测资料,采用串联质谱法检测血酰基肉碱水平,全外显子基因测序法检测基因变异。结果:6例CPT2缺乏症患儿中男性4例、女性2例,平均确诊年龄为32个月(15 d~9岁)。其中1例无临床症状及实验室检查异常、2例迟发型、3例婴儿型。3例由新生儿筛查确诊;3例因临床表现就诊,起病时有发热、肌肉乏力伴肌酶增高。5例患儿表现为游离肉碱降低,棕榈酰基肉碱、十八碳烯酰肉碱升高。6例患儿检测到CPT2基因变异8个位点(携带双位点突变4例,携带单位点突变2例),3种为已知变异(p.R631C、p.T589M和p.D255G),5种为新报道变异(p.F352L、p.R498L、p.F434S、p.A515P、c.153-2A>G)。经PolyPhen2和SIFT软件预测,5个新报道变异中c.153-2A>G和p.F352L为疑似致病变异,p.R498L、p.F434S和p.A515P为临床意义未明变异。结论:CPT2缺乏症临床表型多样,通过新生儿血串联质谱筛查及基因检测有助于早期诊断,确诊后及时治疗大多预后良好。

咪达唑仑原料药及其注射液中醛基类基因毒性杂质测定与含量比较

目的建立测定咪达唑仑原料药及注射液中醛基类基因毒性杂质M 1-[4-氯-2-(2-氟苯甲酰基)苯基]-2-甲基-1H-咪唑-5-甲醛(简称杂质M)含量的超高效液相色谱串联质谱法,比较我国3家生产企业咪达唑仑原料药及注射液、参比制剂中杂质M的含量。方法色谱柱为Acquity UPLC BEH-C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7µm),流动相为含0.1%甲酸的0.01 mol/L甲酸铵水溶液-含0.1%甲酸的乙腈(梯度洗脱),流速为0.4 mL/min,柱温为40℃,进样量为5µL。采用电喷雾电离子源、正离子、多反应监测模式检测,毛细管电压为3.5 kV,脱溶剂温度为350℃,锥孔气流速为60 L/h,脱溶剂气流速为600 L/h。结果杂质M的质量浓度在0.46~9.16 ng/mL(r=0.9992,n=7)和28.62~1144.77 ng/mL(r=0.9953,n=7)范围内与峰面积线性关系良好;检测限为0.03 ng/mL,定量限为0.13 ng/mL;平均加样回收率为98.53%,RSD为4.53%(n=6)。国内3家生产企业的咪达唑仑注射液中杂质M的含量均显著高于原料药(P<0.05);未通过一致性评价的厂家A生产的咪达唑仑注射液中杂质M的含量最高,且显著高于参比制剂(P<0.05)。结论该方法灵敏度高、重复性好,可用于咪达唑仑注射液中杂质M的质量控制。建议未通过一致性评价的生产企业尽快开展一致性评价研究,优化制剂生产工艺,并基于风险评估制订杂质控制策略。

福建泉州地区新生儿戊二酸血症Ⅱ型患者的实验室筛查和基因诊断分析

目的了解福建省泉州地区戊二酸血症Ⅱ型(glutaric acidemia typeⅡ,GA-Ⅱ)新生儿发病率、生化表现与基因突变特征。方法2014年1月~2022年12月,采用串联质谱技术对泉州地区643606例新生儿进行遗传代谢病筛查。对于多种酰基肉碱升高的可疑阳性样本采用MassARRAY技术和高通量测序技术诊断。结果研究期间共有247例新生儿表现为多种酰基肉碱升高,经过基因诊断确诊19例GA-Ⅱ患儿。此外,1例新生儿表现为异戊酰基肉碱(isovalerylcarnitine,C5)升高,疑似为异戊酸血症,经过基因诊断证实为GA-Ⅱ。该研究最终确诊20例GA-Ⅱ患儿,GA-Ⅱ在研究人群中的发病率为1∶32180。新生儿筛查结果表明辛酰基肉碱(C8),癸酰基肉碱(C10)和十二烷酰基肉碱(C12)的浓度明显高于参考范围上限,是筛查GA-Ⅱ的关键指标。在GA-Ⅱ患儿中发现了10种不同的电子转移黄素蛋白脱氢酶(electrontransfer flavoprotein dehydrogenase,ETFDH)基因突变,大部分为错义突变。最常见的ETFDH基因突变是c.250G>A(p.A84T),等位基因突变频率达47.5%,其次是c.524G>A(R175H),c.998A>G(p.Y333C)和c.1657T>C(p.Y553H)。结论新生儿筛查是早期检出GA-Ⅱ患儿的重要途径,但GA-Ⅱ患儿可能出现非典型性的生化改变,所有新生儿筛查结果异常的样本应采用高通量测序进行基因诊断。

乳腺癌组织中整体m6A修饰水平与YTHDF3基因的表达

目的探讨乳腺癌组织中mRNA整体N6-甲基腺苷(m6A)修饰水平和甲基化阅读蛋白关键基因YTHDF3基因在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达。方法通过生物信息学对YTHDF3基因在乳腺癌组织与癌旁组织中的表达差异及乳腺癌患者生存率进行分析;收集乳腺外科手术切除的25例乳腺癌组织和20例癌旁组织(作为对照),利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法分析乳腺癌组织与癌旁组织组中mRNA的整体甲基化水平,通过实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot实验检测YTHDF3基因在乳腺癌组织和癌旁组织中的相对表达量。结果生物信息数据库结果显示,YTHDF3基因在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.001),与癌旁组织比较,YTHDF3基因只有在和81~100岁年龄段表达差异具有统计学意义(P<0.05),乳腺癌旁组织中YTHDF3基因的表达量明显低于Luminal分型的乳腺癌(P<0.01),利用受试者工作特征(ROC)曲线验证乳腺癌5年生存率和10年生存率曲线下面积(AUC)>0.56、0.60,高表达YTHDF3基因的乳腺癌患者比低表达的患者存活率低((P<0.05);LC-MS/MS结果显示,乳腺癌分子分型中Luminal型的mRNA的整体甲基化水平高于癌旁组织、差异有统计学意义(P<0.05),HER-2过表达型(HER-2 positive)与癌旁组织的整体甲基化水平差异无统计学意义(P>0.05);qPCR检测结果显示,YTHDF3基因的表达量在乳腺癌分子Luminal亚型、HER-2 positive亚型中均高于癌旁组织(P<0.05);Western blot结果显示,乳腺癌中YTHDF3蛋白水平高于癌旁组织(P<0.05)。结论乳腺癌组织中mRNA的甲基化水平高于癌旁组织,并且甲基化阅读蛋白关键基因YTHDF3基因在乳腺癌组织中表达上调。

HPLC-MS/MS法测定磷酸特地唑胺中基因毒性杂质含量

目的:建立高效液相色谱-串联质谱联用(HPLC-MS/MS)方法测定磷酸特地唑胺中基因毒性的含量。方法:采用Waters Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7μm)色谱柱,以20 mmol醋酸铵溶液为流动相A,以乙腈为流动相B,梯度洗脱,采用电喷雾电离源(ESI),正离子模式下选择离子监测(SIM)采集,对m/z 389.1、m/z 310.0离子进行选择性监测。结果:基因毒性杂质TDZA010、TDZA046在限度的30%~150%范围内线性关系良好;检测限均为1 ng·mL^(-1),定量限均为3 ng·mL^(-1);回收率在89.8%~105.3%之间,RSD(n=12)分别为5.3%、4.6%;重复性(n=6)RSD分别为0.4%、3.3%。结论:本方法操作简便、专属性好、灵敏度高,可用于磷酸特地唑胺中基因毒性杂质TDZA010、TDZA046含量的检测。

气相色谱—串联质谱法测定阿哌沙班中2-氯乙酰乙酸乙酯的残留量

目的:建立一种气相色谱—串联质谱(GC-MS/MS)方法,用于测定阿哌沙班中潜在基因毒性杂质2-氯乙酰乙酸乙酯的残留量。方法:用聚乙二醇[VF-WAXms(30 mm×0.25 mm×0.25μm)]为固定液的毛细管色谱柱;进样口温度为230℃;流速1.0 mL/min;载气:氦气;不分流进样。采用电子轰击离子源(EI),选择离子监测模式(SIM)。结果:2-氯乙酰乙酸乙酯在0.05~1.02μg/mL质量浓度范围内呈现良好的线性关系(r=0.9985);定量限浓度是0.02μg/mL;检出限是0.01μg/mL;三份不同浓度水平的平均回收率为97.9%(RSD=4.2%)。结论:所建立的GC-MS/MS测定方法灵敏度高、专属性强和准确度好,可用于阿哌沙班中2-氯乙酰乙酸乙酯的测定。

济宁地区新生儿遗传代谢病串联质谱筛查结果分析

目的:了解济宁地区遗传代谢病的患病率、疾病构成和基因变异类型。方法:采集2022年1月-12月参加新生儿疾病筛查的新生儿足跟血,用串联质谱(tandemmassspectrometry,MS/MS)法检测血中氨基酸、肉碱和琥珀酸丙酮浓度,筛查遗传代谢病。用核酸质谱和二代测序检测突变基因,Sanger测序验证,用百分位数法确定参考值范围。结果:52192例新生儿遗传代谢病MS/MS初次筛查阳性1298例,召回1188例,阳性召回率91.53%(1188/1298)。确诊遗传代谢病32例,阳性预测值2.69%(32/1188),总患病率为1/1631。以氨基酸代谢疾病最常见,占56.25%(18/32),其次为有机酸代谢疾病和脂肪酸氧化代谢疾病,分别占28.13%(9/32)和15.63%(5/32)。常见的突变基因是PAH和MAT1A,有机酸代谢疾病常见的突变基因为MMACHC,脂肪酸氧化代谢疾病常见的突变基因为ACADVL。结论:氨基酸代谢疾病是济宁地区新生儿最常见的遗传代谢病,其常见突变基因为PAH和MAT1A。建立遗传代谢病MS/MS筛查切值,探讨疾病构成及其热点突变基因位点,有助于遗传代谢病的早期诊断和精准治疗。

基因分型方法在结核分枝杆菌分型中的应用进展

结核分枝杆菌(Mtb)基因分型在结核病流行病学研究中应用广泛,对结核病疫情的监测、溯源和防控具有重要意义。Mtb基因分型方法中,IS6110限制性片段长度多态性分型曾经是国际公认的Mtb分型的“金标准”,但其缺陷明显,包括分型能力不足、对样本质量要求高和实验操作繁琐等;间隔区寡核苷酸分型技术操作简便且成本较低,稳定性较高,但其分型能力同样不足,结果可能趋向同型化;长序列多态性分型可以简便、快速鉴别牛型、人型和北京基因型菌株,并且在遗传进化研究中发挥重要作用;可变数目串联重复序列分型的分辨率高、可重复性好,可以根据不同情况优化位点组合,已经成为结核分子流行病学研究的重要方法;单核苷酸多态性分型具有高通量、高分辨率和结果准确性高等优点,在结核分子流行病学上的应用非常广泛,有望成为Mtb分型的下一个金标准。

GC-MS/MS法测定缬沙坦氨氯地平片(Ⅰ)中亚硝胺类基因毒性杂质

建立气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)同时测定缬沙坦氨氯地平片(Ⅰ)中2个基因毒性杂质N-亚硝基二甲胺(NDMA)和N-亚硝基二乙胺(NDEA)的含量。采用Agilent DB-WAXms(30 m×0.25 mm,0.25μm)毛细管柱进行分离,程序升温,载气流速3 mL/min,进样体积3μL。质谱分析采用电子轰击(EI)离子源,多反应监测模式,外标法定量。结果表明,NDMA、NDEA及相邻色谱峰之间的分离度好,NDMA浓度在0.25 ng/mL~100 ng/mL、NDEA浓度在0.1 ng/mL~50 ng/mL范围内,线性关系良好。NDMA和NDEA的定量限分别为0.2 ng/mL和0.3 ng/mL,检测限分别为0.07 ng/mL和0.1 ng/mL。精密度、重复性、稳定性试验的RSD均小于8%,NDMA的平均回收率为91.2%~98.1%,NDEA的平均回收率为89.9%~96.3%,本方法简便快捷,专属性强,灵敏度、准确度高、线性范围宽,可用于测定缬沙坦氨氯地平片(Ⅰ)中NDMA和NDEA的含量。

大肠杆菌ppsA和tktA基因的串联表达

ppsA和tktA是芳香族氨基酸生物合成中心途径的两个关键酶基因 ,在大肠杆菌中 ,ppsA基因编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A(PpsA) ,该酶催化丙酮酸合成磷酸烯醇式丙酮酸 ;tktA基因编码转酮酶A ,该酶在磷酸戊糖途径中生成 4 磷酸赤藓糖起主要作用。采用PCR方法从大肠杆菌K 12株中扩增到ppsA和tktA ,并实现了两基因的高效表达 ,其中ppsA活性提高了 10 .8倍 ,tktA活性提高了 3.9倍 ,当这两个基因串联在一个质粒上导入大肠杆菌进行表达时 ,PpsA的活性变化较大 (2 .1～ 9.1倍 ) ,TktA的活性相对稳定 (3.9～ 4 .5倍 ) ,且这两个基因单独表达和串联表达都能使芳香族氨基酸生物合成共同途径中关键中间产物DAHP的产量提高 ,且串联表达比单独表达较高。