金黄色葡萄球菌fnbB基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起奶牛乳房炎主要致病菌之一,主要通过其菌体表面的黏附素侵入寄主细胞引起疾病,为奶牛业造成巨大损失。金黄色葡萄球菌表面蛋白纤连蛋白结合蛋白(fibronectin-binding protein,FnBP)是其关键的黏附因子,在研制抗金黄色葡萄球菌的新型疫苗中占有重要地位.本文根据GenBank中纤连蛋白结合蛋白B基因(fnbB)序列设计特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得3458bp的DNA片段。使用T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM Teasy Vector中,成功构建出了克隆质粒pGEM-fnbB。以BamHI和XhoI双酶切pGEM-fnbB和pET28a(+),并将纯化的基因fnbB亚克隆至pET28a(+)中,构建出原核表达质粒pET28a-fnbB,并将其转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中,经1mmol/L的IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在约165ku处出现了与预期目的蛋白相一致的外源蛋白带,Western blot分析结果表明该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性。金黄色葡萄球菌pET28a-fnbB成功表达为金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的诊断和研究新型疫苗奠定基础。

金黄色葡萄球菌fnbA和fnbB基因及fnbAB双基因缺失突变体菌株的构建

目的 构建纤维连接蛋白结合蛋白 （ FnbP）基因fnbA、fnbB及fnbAB基因敲除质粒并构建相应基因缺失金黄色葡萄球菌菌株。方法 提取金黄色葡萄球菌NCTC8325菌株的基因组，以合成的含有GGGG-attB1的基因特异性序列为引物，采用PCR技术分别扩增目的基因片段，应用Gateway基因克隆技术，通过BP反应与含有attP1和attP2的pKOR1质粒载体混合，在attB和attP之间发生位点特异性重组，构建成含有fnbA 、fnbB和fnbAB基因敲除质粒，再电转到金黄色葡萄球菌菌株NCTC8325。结果 构建质粒pKOR1dfnbA、pKOR1dfnbB和pKOR1dfnbAB测序结果正确，经PCR验证，质粒pKOR1dfnbA、pKOR1dfnbB和pKOR1dfnbAB均成功电转入金黄色葡萄球菌NCTC8325菌株。结论 成功构建fnbA、fnbB和fnbAB基因敲除金黄色葡萄球菌菌株NCTC8325，为研究FnBPA 和FnBPB在金黄色葡萄球菌感染机制中的作用提供了有力工具。

金黄色葡萄球菌fnbB基因D2-D3编码区克隆及其植物表达载体构建

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要致病菌,其表面的纤连素结合蛋白(FnBP)在介导金黄色葡萄球菌侵入寄主细胞的过程中发挥着重要作用。因此,FnBP成为奶牛乳腺炎亚单位疫苗研究中的重要靶标。本研究根据Genbank中纤连素结合蛋白B基因(fnbB)D区编码序列设计引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,PCR扩增D2-D3区,将该片段回收后与pCAMBIA3301植物表达载体同时进行NcoⅠ和Eco 065Ⅰ(BstEⅡ)双酶切,酶切片段回收后进行连接,将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,通过菌落PCR、酶切鉴定等方法筛选阳性克隆,将阳性克隆送公司测序确定DNA序列。结果表明,阅读框架正确,氨基酸序列无突变,成功构建金黄色葡萄球菌fnbB基因D2-D3区植物表达载体。该研究为研制奶牛乳腺炎转基因植物口服疫苗奠定了基础。