双荧光素酶报告系统鉴定miRNA-3133对200kD黏着斑激酶家族相互作用蛋白基因的靶向调控作用

目的通过构建分子量大小为200 kD的黏着斑激酶家族相互作用蛋白(FIP200) 3’UTR双荧光素酶报告基因载体,研究FIP200与mi R-3133的靶向关系。方法采用生物信息学软件targetscan预测mi R-3133与FIP200 3’端非翻译区(3’UTR)潜在的互补结合位点;利用PCR扩增FIP200基因3’UTR序列,并克隆到psicheck2载体中,构建FIP200野生型和突变型重组双荧光素酶报告基因载体;将野生型psicheck2-FIP200-wt 3’UTR或突变型psicheck2-FIP200-mut 3’UTR双荧光素酶报告质粒分别与mi RNA-3133 mimics或mimics-NC共转染CNE-1细胞;通过双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性,观察mi RNA-3133对FIP200表达的影响。结果生物信息学分析显示FIP200 3’UTR与mi RNA-3133有潜在的结合位点,酶切和测序结果表明野生型和突变型双荧光素酶报告载体构建成功;双荧光素酶报告系统检测显示,mi RNA-3133可抑制野生型FIP200载体的荧光素酶的表达(P <0.05),而对突变型载体的荧光素酶表达无影响(P> 0.05)。结论成功构建FIP200基因3’UTR的双荧光素酶报告载体,mi RNA-3133可以直接靶向调控FIP200基因的表达。