青海部分地区牦牛腐蹄病病原分离及鉴定

为了解青海部分地区牦牛腐蹄病病原流行情况,本研究对从格尔木市和河南县某牦牛养殖合作社采集的38份牦牛腐蹄病病料进行了常规细菌分离、API20A生化鉴定及16S rDNA基因的PCR扩增与测序。细菌分离结果显示:从格尔木市采集的18份病料中分离出1株坏死梭杆菌,从河南县采集的20份病料中分离出1株魏氏梭菌。测序和序列分析显示:分离获得的2种病原菌的16S rDNA基因序列与GenBank中坏死梭杆菌、魏氏梭菌序列间的同源性分别为33%~35%、98%~100%。研究结果可为后期牦牛腐蹄病的预防和控制提供理论参考。

牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株白细胞毒素基因的原核表达及其免疫活性分析

参考羊腐蹄病坏死梭杆菌白细胞毒素蛋白的抗原表位基因序列,利用DNAStar软件预测了牛腐蹄病坏死梭杆菌白细胞毒素蛋白的5个抗原表位区,设计5对在上游和下游含有特异性限制性内切酶的引物,以牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株白细胞毒素基因阳性质粒pMD18-T-lkrA为模板,PCR扩增了预测的5个抗原表位区基因,分别命名为PL1、PL2、PL3、PL4和PL5,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6p-1和pPROEX HTa后转化E.coli BL21(DE3),37℃条件下,用IPTG诱导表达,结果PL1、PL2、PL4和PL5在pGEX-6p-1中获得了表达,而PL3在pPROEX HTa中获得了表达。Westem blot试验结果表明,牛腐蹄病坏死梭杆菌H05菌株白细胞毒素蛋白5个抗原表位区的重组蛋白PL1、PL2、PL3、PL4和PL5均与坏死梭杆菌多克隆血清反应。

腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白的基因克隆与表达

用 PCR技术从腐蹄病 E型节瘤拟杆菌克隆出具免疫保护性抗原 0 .93 kb纤毛蛋白基因 ( Pili基因 ) ,利用该基因构建了纤毛蛋白基因表达载体。先将 PCR产物 Pili基因克隆于 TA Cloning System,扩增后 ,用Eco R 酶切 ,低熔点胶回收 ,经 Klenow补平后 ,用 T4DNA连接酶与中间载体 p PLλ连接 ,将 Pili基因克隆于 p PLλ载体 ;经 Bam H 、Bgl 、Pvu 和 Smal +Bgl 酶切鉴定和 p PLλ-Pili重组质粒 Pili基因序列测定正确后 ,扩增 p PLλ-Pili重组质粒 ,用 Bam H 酶切出 2 .1 kb大小的片段 ,回收后 ,与 p ME2 90表达质粒连接 ,转染宿主细胞 PAK/2 pfs,在营养肉汤中进行 Pili基因的表达。培养 1 8～ 2 4 h后 ,离心 ,向上清液中加入 0 .1mol/L Mg Cl2 提取重组纤毛蛋白。用羊抗兔 E型节瘤拟杆菌抗血清与提取的重组纤毛蛋白进行对流免疫电泳 ,证明重组纤毛蛋白具有特异性 ;染料结合法测定 1 0 0 0 m L上清液中表达纤毛蛋白粗含量约为 1 1 4mg。SDS-PAGE测定重组纤毛蛋白的表达量占总菌量的 1 1 .8%,Western

奶牛腐蹄病诊断方法研究进展

奶牛腐蹄病是在世界范围内发生的一种奶牛常见病,严重影响奶牛的生产性能,给奶牛养殖业造成巨大的经济损失。坏死杆菌是奶牛腐蹄病的主要病原菌,近年来得到了广泛而深入的研究。作者在本实验室研究成果基础上,对奶牛腐蹄病坏死杆菌的病原诊断研究进展作一综述,望为奶牛腐蹄病的早期诊断和及时治疗提供参考。

坏死梭杆菌研究进展

坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum,Fn)是一种严格厌氧的革兰阴性多形态杆菌,其致病因子包括内毒素、白细胞毒素、血小板凝集因子、血凝素和溶血素等,其中主要的致病因子是白细胞毒素。由坏死梭杆菌引起的疾病在不同国家和地区均有发生,鹿、羊等反刍动物感染坏死梭杆菌时表现为跛行,关节肿大,肝脓肿和腐蹄病,猪、马等动物感染坏死梭杆菌时主要表现为跛行,严重时继发其他细菌感染,对养殖业造成巨大损失;人类感染该细菌时表现为急性咽炎综合征(Lemierres syndrome)。论文通过对国内外坏死梭杆菌及其疫苗研究和新型佐剂的开发进行综述,以期为该细菌疫苗的研制提供参考。

PCR法诊断奶牛腐蹄病坏死梭杆菌的研究与应用

试验根据坏死梭杆菌白细胞毒素基因序列的特异性,设计1对引物FLP并建立了PCR检测方法。试验结果表明,引物FLP具有相对较高的特异性和敏感性,其敏感性达到了48.5pg。对现地采集奶牛蹄部病料进行PCR检测,发现引物FLP具有很好的特异性,能够准确诊断出坏死梭杆菌的存在。

梅花鹿致病性源坏死梭杆菌的分离与鉴定

为确定湖北省恩施自治州某鹿场致患病鹿蹄腐烂的病原菌,本研究于患病梅花鹿的前蹄病健结合处采集病料并对其进行细菌分离培养,最终分离到一株厌氧菌。对该细菌进行了形态观察、生化试验、16S rRNA基因序列测定、细菌生化鉴定仪鉴定、药物敏感性试验以及小鼠致病力试验等。结果显示该细菌在显微镜下呈革兰氏阴性、丝状、长短不一的杆菌。16S rRNA基因序列测定结果显示该分离菌株与多株坏死梭杆菌参考株的同源性均为99%,将其命名为HNFnf;经Vitek细菌鉴定仪鉴定该细菌为坏死梭杆菌;药敏试验结果显示,该菌对青霉素、头孢类等中度敏感,对阿米卡星、链霉素、庆大霉素耐药。本研究为临床治疗由坏死梭杆菌引起的反刍动物"腐蹄病"与"肝脓肿"提供参考依据。

奶牛腐蹄病坏死杆菌分离鉴定及白细胞毒素基因lktA1序列分析

为分离纯化奶牛腐蹄病坏死杆菌,分析其与其他菌株的亲缘关系,本研究利用坏死杆菌白细胞毒素特异性引物,对奶牛腐蹄病病牛蹄部拭子样品进行了PCR检测,利用厌氧培养基对PCR检测阳性样品进行了坏死杆菌的分离培养,以分离的坏死杆菌基因组DNA为模板,对白细胞毒素基因进行了克隆和序列分析。结果显示,9份奶牛腐蹄病病牛蹄部拭子样品PCR检测结果均为阳性,对其中一份样品中的坏死杆菌进行分离培养,获得了纯培养物,命名为bFR13-1。坏死杆菌bFR13-1菌株白细胞毒素基因测序结果显示,与GenBank已发表的H05、A25和B35菌株的白细胞毒素基因在核苷酸水平的同源性分别为98.40%、98.35%和90.79%,推导氨基酸的同源性分别为97.7%、97.6%和89.0%。进化树分析结果显示,坏死杆菌bFR13-1菌株白细胞毒素与H05菌株的同源性最高,bFR13-1菌株与H05菌株和A25菌株呈较近亲缘关系。结果表明,不同坏死杆菌分离株的白细胞毒素呈现一定的变异性,这种变化是否与坏死杆菌致病性相关,值得深入研究。

坏死梭杆菌QL03株绵羊感染模型的建立及免疫保护性试验

坏死梭杆菌是奶牛腐蹄病的重要致病菌。用奶牛源坏死梭杆菌QL03分离株以不同浓度菌量感染绵羊蹄部,通过观察绵羊蹄部感染情况、病理变化和动物回归试验,建立了坏死梭杆菌分离株绵羊感染模型。并通过绵羊免疫保护性试验验证了绵羊作为奶牛源坏死梭杆菌QL03分离株动物模型的可行性,为进一步研究坏死梭杆菌有效的疫苗奠定实验基础。

腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白与绵羊白细胞介素-2融合基因表达载体的构建及表达

根据腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因 (Pili基因 )序列 ,在 Pili基因 6 19bp Ehe 酶切位点上插入绵羊白细胞介素 - 2基因 (Ovi IL- 2基因 ) ,构建了 Pili基因与 Ovi IL- 2基因的融合基因表达载体。先用 Eco R 、Bam H 双酶切p Bluescript- Ovi IL - 2重组质粒 ,获得两端具有 Eco R 、Bam H 位点的 Ovi IL - 2基因片段 ,用 Klenow补平后 ,与经Ehe 酶切后的重组质粒 PME2 90 - Pili进行平端连接 ;转化 JM10 5感受态细胞 ,筛选阳性克隆 ,分别用 Bam H 、Eco R 、Xba 、Bgl 、Pvu 等进行酶切鉴定。然后将阳性重组质粒转染 BL - 2 1表达宿主感受态细胞 ,用 0 .1m ol/ L Mg Cl2沉淀法和超声波裂解法提取 BL- 2 1表达 Pili基因与 Ovi IL- 2基因融合基因表达蛋白。对流免疫电泳对重组融合蛋白的特异性分析证明 ,融合蛋白主要在宿主菌体中表达 ;SDS- PAGE电泳结果表明 ,重组融合蛋白分子大小约为 330 0 0 ,表达产物的量约占菌体的 5 .49%。

腐蹄病C型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因的克隆与表达

用 PCR从腐蹄病 C型节瘤拟杆菌扩增出具有免疫保护性抗原 0 .85 kb纤毛蛋白基因 (pili基因 ) ,并构建了该基因的表达载体。转化宿主细胞 PAK/2 pfs,在营养肉汤中进行 pili基因的表达。培养 18～ 2 4h后 ,收集培养液上清 ,加入 0 .1mol/L Mg Cl2 ,离心提取重组纤毛蛋白。用羊抗兔 C型节瘤拟杆菌抗血清与提取的纤毛蛋白进行对流免疫电泳试验 ,结果表达的重组纤毛蛋白有特异性 ;用 SDS- PAGE和 Western- blot证明表达的蛋白是 C型节瘤拟杆菌纤毛蛋白。

基于^1H NMR技术的急性腐蹄病奶牛血清代谢组学分析

通过^1H核磁共振（^1H NMR）技术结合主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析法（OPLS-DA）,分别分析奶牛在患有急性腐蹄病时内源性代谢产物的变化,研究腐蹄病的发生对奶牛代谢过程的影响,寻找差异表达的代谢物。运用^1H NMR技术获得两组奶牛血清代谢谱。所采集的数据经过模式分析获得差异代谢物。结果急性腐蹄病组与健康对照组相比,奶牛血清内差异性代谢物为21个。结果显示,在奶牛发生腐蹄病时体内糖类、氨基酸、脂类和能量代谢均发生了改变。表明结合^1H NMR谱检测分析的急性腐蹄病组对照组比对的差异代谢物,全景式地揭示了腐蹄病发生过程中奶牛机体内发生了广泛的代谢紊乱,为今后深入探究腐蹄病的发病机理和新的防治策略奠定了基础。

腐蹄病C型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因的克隆与表达载体的构建

用 PCR技术从腐蹄病 C型节瘤拟杆菌克隆出具有免疫保护性抗原 0 .85kb纤毛蛋白基因 ( pili基因 ) ,利用该基因构建了纤毛蛋白基因表达载体。提取 C型节瘤拟杆菌染色体DNA;用所设计的专一性引物进行 PCR,扩增出 pili基因 ;将 pili基因克隆于 TE载体 ,TE-pili重组质粒 pili基因序列测定结果正确 ,用 Eco R 酶切 ,低熔点胶回收 pili基因片段 ,经 klenow补平后 ,用 T4DNA连接酶将其与中间载体p PLλ连接 ,将 pili基因克隆于 p PLλ载体 ,经Bam H 、Bam H +Hind 、Dral酶切鉴定 pili基因正向插入 p PLλ载体 ;扩增 p PLλ-pili重组质粒 ,用 Bam H 酶切出 2 .1 kb大小片段 ,回收后 ,与 PME2 90表达质粒连接 ,转化宿主细胞PAK/ 2 pfs中 ,对获得的重组质粒用 Bam H 酶切 ,出现 2 .1 kb大小的带 。

牛腐蹄病坏死杆菌H05菌株白细胞毒素基因的克隆与序列分析

以黑龙江省分离的牛腐蹄病坏死杆菌H05菌株基因组DNA为模板,参考GenBank发表的羊腐蹄病坏死杆菌A25菌株白细胞毒素基因核苷酸序列,设计5对覆盖白细胞毒素基因完整开放阅读框(ORF)的引物,通过PCR扩增获得了H05菌株白细胞毒素基因5个相互重叠的DNA片段,将它们克隆到pMD18-T载体中。测序结果显示:牛腐蹄病坏死杆菌H05菌株白细胞毒素基因长为9723bp,编码一个3240个氨基酸的蛋白质,与羊腐蹄病坏死杆菌白细胞毒素蛋白的核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.75%和99.63%,缺失了1078位的天冬酰胺。

节瘤拟杆菌PCR检测方法的建立

根据节瘤拟杆菌特有保守序列设计引物,利用聚合酶链式反应(PCR)建立了一种鉴别检测该菌的方法。对可能影响PCR检测结果的一系列因素进行了较详细的研究,选择了适宜PCR检测的快捷处理病样获得反应模板的方法,对PCR反应条件进行了优化,使对已知菌株培养物检测灵敏性最高可到30个菌/30μL反应体系;用广泛的相关菌株和菌群验证引物的特异性,证明设计的引物特异性强。将PCR方法用于临床病样的初步检测,部分病样PCR检测阳性。为用PCR方法检测节瘤拟杆菌引发的牛、羊、鹿腐蹄病奠定了基础。

奶牛腐蹄病节瘤拟杆菌PCR检测法研究

腐蹄病是指侵害指(趾)间皮肤及皮肤更深层软组织的急性或亚急性炎症。患病皮肤常坏死、裂开,炎症从指(趾)间皮肤蔓延到蹄冠、系部和球节,病肢明显跛行,并伴有全身性症候。腐蹄病是奶牛蹄病中危害性极为严重的一类疾病,病畜食欲减退、泌乳量下降、繁殖能力降低,病情严重者将被迫淘汰,严重影响奶牛业的发展,造成严重的经济损失。鉴于该病对奶牛业的严重危害,奶牛出现蹄病时的及时、准确临床诊断,以及与其他蹄病的鉴别诊断,对于奶牛蹄病的临床治疗和预防具有重要的实际指导意义。本试验根据节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因序列的特异性,设计1对引物BPP并建立了PCR检测方法。试验结果表明,引物BPP具有相对较高的特异性和敏感性,其敏感性达到了152.5 pg,且引物FLP具有很好的特异性,能够准确诊断出节瘤拟杆菌的存在。

弹性硬蛋白溶解试验鉴别反刍动物腐蹄病节瘤拟杆菌强毒株

根据腐蹄病节瘤拟杆菌毒力菌株具有溶解弹性硬蛋白的特性，利用弹性硬蛋白培养基建立了弹性硬蛋白溶解试验，以鉴别节瘤拟杆菌强毒株。试验表明，将不同毒力的菌株同时接种于弹性硬蛋白培养基，蛋白溶解带出现的时间和宽度都显著不同，强毒株大多在７ｄ内，少部分在７～１１ｄ内均出现一条明显的蛋白溶解带；而弱毒株在２１ｄ内基本上未见蛋白溶解带出现。

腐蹄病A型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因的克隆与序列分析

以腐蹄病A型节瘤拟杆菌染色体DNA为模板,根据设计的上、下游引物进行PCR反应,扩增出了大小约0.78kb的基因片段,用T_4DNA连接酶将PCR产物与pGEM-T-Easy载体连接,构建了重组质粒。并以EcoRV和SalI双酶切重组质粒鉴定目的基因的插入方向。经序列测定,克隆的目的基因片段为Pili基因。

节瘤拟杆菌PCR检测方法的初步应用

本研究在建立节瘤拟杆菌PCR检测方法的基础上,将PCR方法用于临床样品的检测。PCR检测发现制约PCR直接检测临床样品检出率的主要因素是临床样品中细菌外的抑制物;采自趾叉皮炎的临床样品16份PCR检测呈阳性,趾叉皮炎是腐蹄病的初期感染症状;而其它蹄病后期症状临床样品PCR检测均为阴性,表明PC R检测方法适宜腐蹄病的早期诊断。

腐蹄病C型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因的克隆与序列分析

提取C型节瘤拟杆菌染色体DNA。用PCR技术从腐蹄病C型节瘤拟杆菌克隆出具有免疫保护性抗原 0 .85kb纤毛蛋白基因 ( pili基因 ) ,将PCR产物pili基因克隆于TE载体 ,在含X - gal和IPTG的AmpLB平板上 ,挑选白色单一菌落进行质粒的筛选 ,用EcoR1酶切提取重组质粒 ,琼脂糖凝胶电泳 ,出现一条 0 .85kb的条带 ,从而筛选出TE - pili重组质粒。对 pili基因进行序列测定 ,结果与国外报道的 pili基因序列一致。