血清4型禽腺病毒Taq Man探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立快速检测血清4型禽腺病毒病(Fowl aviadenovirus serotype 4,FAdV-4)的基于Taq Man探针的Quantitative real-time PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Hexon基因序列,设计相关的qPCR特异性引物和探针,经特异性、敏感性和重复性试验以及反应程序等系列优化后,最终建立荧光定量检测方法并应用于临床样品的病原检测。FAdV-4的qPCR结果表明,优化后标准曲线决定系数(R^(2))为0.998,扩增效率(E)为95.226%,该方法效果良好。利用该方法,除FAdV-4外其他禽类常见病原均未检测到,该方法具有良好的特异性。该qPCR方法检出阳性的最低拷贝数为100个拷贝,而普通PCR方法检出阳性的最低拷贝数为10000个拷贝,说明其具有良好的灵敏度。组内和组间变异系数均≤0.22%,该方法的重复性较高。对180份从江苏、安徽、江西和广西等省份采集的临床疑似样品进行检测,结果显示,qPCR方法检出率为51.1%,而普通PCR方法检出率为32.8%;同时基于qPCR引物的检出符合率为100.00%,而基于普通PCR特异性引物检出的符合率为82.35%,表明该qPCR方法针对临床疑似样品的检测准确性更高。该方法的建立有助于推动禽腺病毒病的分子流行病学研究和防控。

血清4型禽腺病毒的分离鉴定及动物回归试验

吉林省长春市某蛋鸡场49日龄蛋鸡发生以心包积液为剖检特征的传染性疾病,造成大批鸡死亡。我们对病死鸡进行了临床检查、细菌学检查、血凝试验、试纸条检测、病毒的初步分离及PCR检测,采集的尿囊液命名为FADV-4CC株,并用分离的病毒攻毒SPF鸡。结果显示,剖检可见病鸡心脏被淡黄色透明液体包裹,肝脏肿大变黄、有出血点,未见血凝现象,禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒以及细菌学检测均呈阴性,PCR检测出现明显的目的条带,初步判定为血清4型禽腺病毒,攻毒的SPF鸡全部死亡,对照组正常存活无异常。试验表明,吉林长春地区仍有禽腺病毒病流行,且是各日龄均易感的血清4型禽腺病毒。

禽腺病毒血清4型纳米PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速有效检测禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的方法,本研究根据FAdV-4五邻体(Penton)基因序列,设计合成1对特异性引物,经过条件优化,建立了检测FAdV-4的纳米PCR方法(Nano PCR)。特异性试验结果显示,该方法对鸡新城疫病毒等12种家禽常见病原及国内报导的FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11等5个主要血清型病毒的扩增结果均为阴性,仅FAdV-4检测结果为阳性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对FAdV-4的最低核酸检出量为54.0拷贝/μL,较常规PCR方法高10倍,敏感性较高。应用该方法和病毒分离培养法同时对87份临床样品进行检测,二者均检出14份阳性样品,总体符合率为100%。以上结果表明本研究建立的Nano PCR方法特异性好、敏感性高,可以用于FAdV-4的临床检测和分子流行病学调查。

禽腺病毒血清4型Y17215-1株对SPF鸡胚及SPF鸡的致病性研究

为了探究一株禽腺病毒血清4型(FAdV-4)天津分离株Y17215-1对SPF鸡胚及SPF鸡的致病力,试验将Y17215-1株(病毒效价为1×10^(6.5) TCID_(50)/0.1 mL)经卵黄囊和尿囊膜两种接种途径分别接种6,10日龄SPF鸡胚,经滴鼻点眼和肌肉注射两种途径分别接种7,14,21日龄的SPF鸡,观察SPF鸡胚死亡情况和病理变化情况,统计SPF鸡发病死亡情况,检测试验鸡不同组织及不同采集时间的泄殖腔中的病原,观察试验鸡的临床病变和组织病理学变化。结果表明:两种接种途径均可致鸡胚死亡,经卵黄囊途径接种致死的鸡胚可见胚体全身出血,经尿囊膜途径接种致死的鸡胚尿囊膜明显增厚;两种接种途径均可引起不同日龄SPF鸡发病和死亡,且肌肉注射组试验鸡较滴鼻点眼组试验鸡发病快、病程短,致死率高,发病鸡临床表现为精神沉郁、采食量明显下降、排黄绿色粪便。心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腺胃等器官病原检测结果均为阳性,各试验组的泄殖腔拭子样品在感染后第2天即可检测到FAdV-4。剖检可见典型的心包积水、肝脏肿大、肾脏肿大等病变,肝细胞内有嗜酸性包涵体。说明FAdV-4天津分离株Y17215-1对鸡胚及鸡具有较高致病性。