FOXO蛋白的修饰与细胞凋亡和癌变

Fox蛋白家族是2000年才发布统一命名的蛋白质家族.由于其在生物体内所起的重要作用,已迅速成为生命科学研究的热点.目前,已经发现其家族成员有100多种,其中,FOXO亚家族在动物细胞的凋亡中起重要作用.细胞凋亡与动物的长寿、繁殖、代谢、肿瘤发生及免疫有重要关系,对Forkhead(Fox)蛋白分子的命名进行了回顾、对其分类与结构特征进行了总结,并重点对FOXO的化学修饰、活性调节及其在细胞凋亡和肿瘤发生中的作用进行了综述.

叉头框蛋白O3a在失神经肌萎缩中的研究进展

骨骼肌失神经后,肌纤维直径和横截面积减小,导致肌肉质量下降。实验证明,叉头框蛋白O3a(FoxO3a)作为叉头框转录因子亚家族O重要成员之一,对失神经肌萎缩有着重要的调节作用。本文从FoxO3a的结构和功能、上游翻译后修饰和下游靶基因的调控方面,阐述其作为重要的治疗靶点在失神经肌萎缩中的重要意义,旨在未来延缓失神经肌萎缩方面提供精准的理论依据并寻求新的靶点和治疗方法。

FOXO蛋白在肿瘤形成中的作用机制研究进展

FOX蛋白是2000年发布统一命名的一组蛋白质家族,是一种较新的蛋白质。由于其在生物信息系统中的重要作用,已经迅速成为生命科学研究中的热点。目前发现FOX蛋白对肿瘤形成、衰老、细胞增殖和代谢、免疫调节等方面均发挥重要作用。FOXO蛋白作为FOX蛋白家族中研究最为深入的一个亚家族,与肿瘤形成的关系十分密切。文中着重从FOXO蛋白参与染色体易位以及对其磷酸化、乙酰化、亚细胞定位、降解的活性调节和细胞信号传导方面简要阐述它在肿瘤形成中的作用机制。

Foxo3a蛋白表达水平、Foxp3^+百分比与慢性乙型肝炎患者病情的相关性分析

目的:探讨Foxo3a蛋白表达水平、Foxp3^+百分比(CD4^+CD25^+Foxp3^+/CD4^+CD25^+)与慢性乙型肝炎(CHB)患者病情的相关性。方法:选择2013年1月至2016年1月四川省达州市中心医院感染内科收治的176例CHB患者为观察组,根据病情分为轻度组、中度组、重度组;并以同期的100例健康体检者为对照组。检测各组血清HBV-DNA病毒载量及血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBil)水平,并检测外周血Foxp3^+百分比及Foxo3a蛋白的表达。采用Pearson相关性分析方法分析Foxo3a表达、Foxp3^+百分比与患者病情的相关性。结果:观察组HBV-DNA病毒载量,血清ALT、AST、TBil水平,CD4^+CD25^+Foxp3^+/CD4^+CD25^+和Foxo3a蛋白表达水平均显著高于对照组,且随着病情加重上述指标均显著升高(均P<0.05)。经Pearson相关性分析CD4^+CD25^+Foxp3^+/CD4^+CD25^+、Foxo3a蛋白分别与HBV、ALT、AST、TBil含量呈正相关关系(均P<0.05)。结论:Foxo3a蛋白表达、CD4^+CD25^+Foxp3^+/CD4^+CD25^+与CHB患者HBV感染及肝功能损害呈正相关关系,可作为临床检测指标。

重组脂联素对自然流产模型小鼠子宫蜕膜组织中FOXO3蛋白表达的影响

目的探讨重组脂联素对自然流产模型小鼠子宫蜕膜组织中FOXO3蛋白表达的影响。方法将24只自然流产模型小鼠按照随机数字表法分为3组—模型组、脂联素1组、脂联素2组,每组8只。3组分别给予小鼠腹腔注射重组脂联素,剂量分别为0、0.1、1 mg/kg,1次/d,连续应用14 d。治疗第7天与治疗第14天,观察胚胎情况,计数吸收胚胎数和存活胚胎数;检测脂联素、白细胞介素-17(IL-17)、转化生长因子-β(TGF-β)等表达水平;检测脾脏CD4+CD25+T细胞比率;检测子宫蜕膜组织中FOXO3蛋白表达变化情况。结果治疗第7天与治疗第14天,脂联素1组、脂联素2组的胚胎吸收率均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05),脂联素2组低于脂联素1组,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗第7天与治疗第14天,脂联素1组、脂联素2组的血清脂联素、TGF-β水平高于模型组,血清IL-17水平低于模型组,脂联素2组与脂联素1组对比,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗第7天与治疗第14天,脂联素1组、脂联素2组的脾脏CD4+CD25+T细胞比率高于模型组(P<0.05),脂联素2组高于脂联素1组,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗第7天与治疗第14天,脂联素1组、脂联素2组的子宫脱膜组织FOXO3蛋白相对表达水平高于模型组(P<0.05),脂联素2组高于脂联素1组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论重组脂联素在自然流产模型小鼠的应用能促进子宫蜕膜组织中FOXO3蛋白表达,提高脾脏CD4^(+)CD25^(+)T细胞比率,调节小鼠的免疫平衡,从而能降低胚胎吸收率。

磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/FoxO1信号通路和白细胞介素17在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎中的表达变化

目的探讨磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/FoxO1和白细胞介素17(IL-17)与自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病的相关机制。方法将C57BL/6小鼠60只随机分为对照组和模型组(EAE),每组30只。采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35~55)联合完全弗氏佐剂诱导建立EAE模型。观察各组小鼠的行为学评分,并于评分4分时取各组小鼠的脊髓、脾脏和外周血。HE染色及Luxol fast blue染色观察脊髓炎性细胞浸润及髓鞘脱失情况;脾细胞在体外用a-CD3和MOG35~55分别刺激7 d,收集其上清液,ELISA检测小鼠脾细胞上清液和血清中细胞因子白细胞介素17(IL-17)和干扰素γ(IFN-γ)的含量;流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4+IL-17+细胞的百分比;Western blotting检测IL-17及PI3K/Akt/FoxO1在小鼠脊髓中表达。结果与对照组相比,EAE组小鼠行为学评分明显高于对照组(P<0.05);HE染色及Luxol fast blue染色结果显示,EAE组脊髓病理组织表现出炎性浸润和髓鞘脱失显著增多(P<0.05)。ELISA结果显示,EAE组血清中及体外培养脾细胞的上清中IL-17和IFN-γ的含量明显升高。流式结果表明,EAE组小鼠脾细胞中CD4+IL-17+T细胞的百分比明显增加(P<0.05)。Western blotting结果显示,EAE组小鼠脊髓IL-17、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白水平明显升高,但磷酸化FoxO1(p-FoxO1)蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论 EAE组小鼠脊髓中促炎因子IL-17分泌增加,可能与PI3K/Akt/FoxO1信号通路活化进而激活T细胞功能有关。

磷酸化FOXO1对高糖刺激的人肾小管上皮细胞脂质沉积的影响

目的:研究叉头框蛋白O1(FOXO1)表达和磷酸化过程对高糖刺激下人肾小管上皮细胞脂质沉积的影响。方法:体外培养人肾小管上皮细胞株HKC,给予高糖刺激后免疫荧光及Western blotting检测总FOXO1、磷酸化FOXO1和固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)的表达,油红O染色测定细胞内脂质沉积;构建野生型和磷酸化位点突变型FOXO1质粒,转染入HKC细胞后给予高糖刺激,采用免疫荧光、Western blotting和油红O染色确定FOXO1磷酸化位点突变对肾小管上皮细胞脂质代谢的影响。结果:高糖刺激HKC细胞48 h后,总FOXO1在正常糖组和高糖组的表达未见差异,而磷酸化FOXO1及SREBP-1表达明显上调,细胞内脂滴显著增加。将构建的野生型FOXO1质粒转染人细胞后,上调了总FOXO1和磷酸化FOXO1的表达,增加了SREBP-1表达和细胞内脂滴含量;而磷酸化位点突变的FOXO1质粒避免了高糖诱导引起的SREBP-1上调和细胞内脂质沉积。结论:磷酸化FOXO1参与了高糖诱导的肾小管上皮细胞SREBP-1上调和细胞内脂质聚集;磷酸化位点的突变可避免高糖引起的肾小管上皮细胞SREBP-1上调和脂质沉积。

SIRT1/FOXO3a/p27信号通路在白藜芦醇抑制肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

目的探讨白藜芦醇(RES)是否通过影响沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)/叉头蛋白O3a(FOXO3a)/p27信号通路抑制肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖,为肺动脉高压新药研发提供一定的理论和实验依据。方法体外培养大鼠PASMC并随机分为三组,对照组不处理,5-HT刺激组加1μmol/L 5-HT,不同浓度RES干预组在加入5-HT前用10、30、100、300μmol/L RES预处理1 h,作用24 h后采用BrdU掺入法检测各组细胞增殖情况并筛选RES作用浓度;为研究机制进一步将PASMCs分为六组,对照组、5-HT刺激组、RES干预组(筛选出的RES作用浓度)处理同前,RES+SIRT1抑制剂干预组、RES+FOXO3a抑制剂干预组在加入1μmol/L 5-HT前用RES分别联合1μmol/L EX527、AS1842856预处理1 h,RES+p27 siRNA转染组在加入1μmol/L 5-HT前预先转染p27 siRNA 24 h后联合RES;作用24 h后采用BrdU掺入法检测各组细胞增殖情况,采用Western blotting法检测对照组、5-HT刺激组、RES干预组、RES+SIRT1抑制剂干预组的FOXO3a、p27蛋白及RES+FOXO3a抑制剂干预组的p27蛋白。结果PASMC增殖率5-HT刺激组高于对照组,100、300μmol/L RES干预组均低于5-HT刺激组(P均<0.05),故以100μmol/L作为后续实验中RES干预的作用浓度。PASMC增殖率5-HT刺激组高于对照组,RES干预组低于5-HT刺激组;RES+SIRT1抑制剂干预组、RES+FOXO3a抑制剂干预组、RES+p27 siRNA转染组均高于RES干预组(P均<0.05),三组间差异无统计学意义。PASMC中FOXO3a、p27蛋白表达量5-HT刺激组均低于对照组,RES干预组均高于5-HT刺激组,RES+SIRT1抑制剂干预组均低于RES干预组(P均<0.05);RES+FOXO3a抑制剂干预组p27蛋白表达量低于RES干预组(P<0.05)。结论RES可通过激活SIRT1上调FOXO3a,进而上调细胞周期抑制蛋白p27,最终抑制PASMC增殖。

PI3K/Akt-FoxO1信号通路在烟草烟雾暴露下单核细胞炎性反应中的作用及机制

目的:通过应用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002及FoxO1-siRNA的作用,明确PI3K/Akt-FoxO1信号通路在烟草烟雾暴露下单核细胞细胞株炎性反应中的重要作用及机制。方法:以U937细胞为研究对象,分为对照组、烟草烟雾提取物(CSE)组、PI3K抑制剂组。应用Brdu法确定实验中CSE的合适浓度。PI3K抑制剂组的细胞给予LY294002预孵育2 h后给予CSE刺激过夜,之后给予TNF-α刺激过夜;CSE组不应用LY294002,其余同抑制剂组;对照组仅给予肿瘤坏死因子(TNF)-α。应用ELISA检测细胞培养上清液中IL-8的水平,应用Western印迹检测PI3K/Akt通路关键蛋白Akt、p-Akt蛋白以及FoxO1及p-FoxO1蛋白的表达。结果:CSE组的IL-8水平明显高于PI3K抑制剂组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05);PI3K抑制剂组的p-Akt表达较CSE组减弱,但较对照组增强,p-FoxO1表达较CSE组增强,但较对照组减弱,差异有统计学意义(P<0.05),Akt及FoxO1表达无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:PI3K抑制剂LY294002可明显减弱通路关键蛋白p-Akt的表达,增强p-FoxO1的表达,进而明显减弱烟草烟雾暴露下单核细胞的炎性反应,PI3K/Akt信号通路活性及其下游FoxO1蛋白的表达与烟草烟雾暴露的单核细胞炎性反应表达有关。

氧化应激通过激活Cdk5抑制FOXO1的神经元损伤及其机制

目的探究氧化应激通过激活细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase 5, Cdk5)抑制叉头框转录因子O亚家族蛋白1(forkhead box O1, FOXO1)的神经元损伤的具体机制。方法在HEK细胞中,共同转染过表达P39/Cdk5和FOXO1-WT或者FOXO1-S249A突变体,利用特异性磷酸化抗体pS249-FOXO1能够特异识别FOXO1的Ser249位点磷酸化特点,通过Western blot检测Cdk5/p39对FOXO1的磷酸化。通过体外培养HEK细胞中过表达Cdk5、p39和FOXO1,免疫共沉淀探究Cdk5和FOXO1以及Cdk5和p39的相互作用。在原代神经元过表达不同的Cdk5激活因子(p25、p35、p39)以及Cdk5激酶复合物,使用双荧光素酶实验探究其不同组合对FOXO1转录活性的影响。用Cdk5抑制剂rocovitine干预,观察其对FOXO1出入的影响;同时通过核质分离的方法对比了Cdk5杂合小鼠和野生型大脑皮层组织的FOXO1核质定位。分别用H_2O_2、glutamate处理神经元,通过Western blot观察氧化应激对Cdk5的活性调节,同时用双荧光素酶实验探究其对FOXO1转录因子的影响;最后通过caspase-3染色观察H_2O_2、glutamate的不同时间梯度处理对神经元凋亡的影响。结果 Cdk5和p39能够直接与FOXO1相互作用,并磷酸化FOXO1的Ser249位点。激活Cdk5能够显著抑制FOXO1的转录活性,而用Cdk5抑制剂(roscovitine)能够显著提高FOXO1的转录活性并诱导FOXO1入核。与野生型对比,在Cdk5杂合子中,FOXO1蛋白在细胞核中定位显著提高。H_2O_2和glutamate处理诱导p35切割形成p25,同时抑制FOXO1的转录活性,而敲低Cdk5能够缓解H_2O_2和glutamate对FOXO1的转录活性的抑制。通过H_2O_2和glutamate处理的原代神经元,caspase3染色显著增加。结论 Cdk5/p39可以磷酸化FOXO1-ser249位点,并抑制FOXO1的转录活性;而氧化应激能够通过激活Cdk5,抑制FOXO1的转录活性,并诱导神经元凋亡。

下调去甲基化酶FTO抑制人肝癌细胞系HepG2增殖

目的 探究去甲基化酶脂肪质量和肥胖相关基因(FTO)抑制对人肝癌细胞系HepG2增殖的作用机制。方法 将肝癌细胞系HepG2分为对照组(转染空质粒)、FTO组(转染FTO过表达质粒)、si-FTO组(转染si-FTO)、si-FTO+si-FoxO1组(同时转染si-FTO和si-FoxO1)。RT-qPCR检测细胞中FTO相对表达量;用CCK-8、Transwell小室法和流式细胞仪分别检测细胞增殖、侵袭和凋亡;Dot blot检测m~6A甲基化水平;蛋白质印迹检测细胞中FoxO1蛋白表达。结果 通过人类癌基因库(TCGA)分析肝癌患者总体生存期发现FTO高表达提示更短的生存期(P<0.05)。和正常肝细胞系HL7702相比,HepG2细胞中FTO表达明显升高(P<0.05)。和对照组相比,si-FTO组细胞中FTO相对表达量明显降低,FTO组细胞中FTO相对表达量明显升高(P<0.05);和si-FTO组相比,si-FTO+si-FoxO1组细胞中FTO相对表达量明显升高(P<0.05)。si-FTO组细胞活性、侵袭细胞数、m~6A相对表达量均低于对照组,细胞凋亡率、FoxO1蛋白表达均高于对照组(P<0.05);FTO组细胞活性、侵袭细胞数、m~6A相对表达量明显高于对照组,细胞凋亡率、FoxO1蛋白表达明显低于对照组(P<0.05);si-FTO+si-FoxO1组细胞活性、侵袭细胞数目、m~6A相对表达量均高于si-FTO组,细胞凋亡率、FoxO1蛋白表达均低于si-FTO组(P<0.05)。结论 高表达FTO与临床预后较差相关,去甲基化酶FTO敲减可抑制肝细胞癌的增殖和侵袭,诱导肝细胞癌的凋亡,其作用机制可能和调控FoxO1表达有关。

miR-365通过靶向FoxO1抑制胃癌细胞的增殖

为了探究miR-365对胃癌细胞活力、增殖的影响及作用机制,使用RT-qPCR技术检测胃癌细胞(AGS和MGC80-3)与正常胃上皮细胞(GES-1)中miR-365的内源性表达水平及临床样本中胃癌组织和癌旁组织中miR-365的内源性表达水平;使用CCK-8检测细胞增殖活力;使用RT-qPCR及Western-blot检测周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)、CDK6、周期蛋白D1(cyclinD1)和FoxO1的mRNA及蛋白质水平;采用荧光素酶报告实验验证miR-365与FoxO13´-UTR的结合能力。实验结果显示,与正常胃上皮细胞相比,两种胃癌细胞内miR-365的表达下调;转染miR-365模拟物后,胃癌细胞的增殖活力下降,cyclinD1、CDK4、CDK6及FoxO1的mRNA和蛋白质水平均下调;miR-365可结合FoxO1的3´-UTR,进而抑制FoxO1蛋白的表达;与癌旁组织比较,癌组织中miR-365的表达降低。以上结果表明,miR-365可通过靶向结合FoxO1的3´-UTR抑制FoxO1蛋白表达,进而抑制胃癌细胞的增殖。

FOXO3和IL-2在干眼患者结膜上皮细胞及泪液中表达及意义

目的:探究叉头框蛋白O3(FOXO3)、白细胞介素-2(IL-2)在干眼(DE)患者结膜上皮细胞及泪液中的表达及意义。方法:前瞻性研究。选择2019-03/2021-03收治的DE患者106例,另选同期85位健康体检者为对照。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测结膜上皮细胞及泪液中FOXO3水平;酶联免疫吸附(ELISA)法检测样本中IL-2水平;分析DE患者治疗前后的泪膜破裂时间(BUT)、泪液分泌试验(SⅠt)、角膜荧光素染色(CFS)等眼表临床指标变化;Pearson相关性分析DE患者结膜上皮细胞、泪液中FOXO3和IL-2水平的相关性以及二者与临床指标的关系。结果:与对照组相比,DE组患者结膜上皮细胞及泪液中FOXO3水平均明显降低,IL-2水平均明显升高(均P<0.01)。与治疗前相比,DE患者治疗后结膜上皮细胞及泪液中FOXO3水平明显上调,IL-2水平明显下调(均P<0.01)。Pearson相关性分析结果显示,结膜上皮细胞、泪液中FOXO3和IL-2水平均呈显著负相关(r=-0.531、-0.469,均P<0.01)。DE患者治疗后BUT、SⅠt指标较治疗前上升,CFS指标下降(均P<0.01)。DE患者结膜上皮细胞FOXO3水平与BUT、SⅠt均呈正相关(r=0.431、0.457,均P<0.01),与CFS呈负相(r=-0.469,P<0.01),IL-2水平与BUT、SⅠt均呈负相关(r=-0.416、-0.447,均P<0.01),与CFS呈正相关(r=0.424,P<0.01);泪液FOXO3与BUT、SⅠt呈正相关(r=0.421、0.443,均P<0.01),与CFS呈负相关(r=-0.474,P<0.01),IL-2与BUT、SⅠt呈负相关(r=-0.408、-0.429,均P<0.01),与CFS呈正相关(r=0.419,P<0.01)。结论:DE患者结膜上皮细胞及泪液中FOXO3水平降低,IL-2水平升高,二者与患者眼表指标存在密切的联系,有望成为DE临床监测和预后评估的实验室辅助指标。

小鼠抗人FOXO3保守区多克隆抗体的制备和鉴定

目的纯化叉头盒蛋白O3(FOXO3)基因保守区蛋白,并制备其多克隆抗体。方法利用生物信息学分析预测FOXO3蛋白的保守区,通过PCR扩增编码FOXO3蛋白第290~472位氨基酸DNA片段并克隆至pET28a原核表达载体中,转化到大肠杆菌BL21,诱导表达并获得可溶性蛋白,经镍离子柱亲和纯化,免疫小鼠制备抗血清,随后采用ELISA、Western blot法和免疫沉淀实验检测抗体的效价、特异性以及应用范围。结果成功构建表达载体pET28a-FOXO3(aa290-472),实现可溶性FOXO3蛋白的表达和抗体制备。SDS-PAGE和Western blot实验结果证实,FOXO3蛋白与预期结果一致,抗血清能够特异性地识别原核、真核FOXO3蛋白以及其天然抗原表位。结论成功制备了小鼠抗人FOXO3的多克隆抗体,且抗体对内源性FOXO3具有较好的反应性和特异性。

特女贞苷对高糖诱导人视网膜微血管内皮细胞损伤的抑制作用及其机制

目的探讨特女贞苷对高糖诱导人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)损伤的抑制作用及其机制。方法将hRMECs分为正常对照组、高渗组、高糖组、高糖+低浓度特女贞苷组、高糖+中浓度特女贞苷组和高糖+高浓度特女贞苷组,分别用含5.5 mmol/L葡萄糖、5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇、30 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖+25、50、100μmol/L特女贞苷的培养液培养24 h。另将hRMECs分为高糖+小干扰RNA阴性序列(si-NC)组、高糖+si-叉头框转录因子O4(FOXO4)组、高糖+特女贞苷+pcDNA组、高糖+特女贞苷+pcDNA-FOXO4组,转染相应试剂后分别用含30 mmol/L葡萄糖或100μmol/L特女贞苷+30 mmol/L葡萄糖的培养液培养24 h。采用流式细胞术检测hRMECs细胞凋亡情况;采用硫代巴比妥酸法检测细胞中丙二醛(MDA)质量浓度;采用黄嘌呤氧化酶法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用ELISA法检测细胞培养上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度;采用Western blot法检测细胞中FOXO4蛋白表达水平。结果正常对照组、高渗组、高糖组、高糖+低浓度特女贞苷组、高糖+中浓度特女贞苷组和高糖+高浓度特女贞苷组细胞凋亡率分别为(7.32±0.72)%、(7.44±0.70)%、(23.96±1.32)%、(19.84±1.09)%、(14.13±0.85)%和(9.84±0.70)%。各组细胞凋亡率、MDA质量浓度、SOD活性值、IL-1β质量浓度、TNF-α质量浓度和FOXO4蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=498.545、1186.693、516.629、654.247、638.238、472.655,均P<0.001),其中与高糖组相比,高糖+低、中、高浓度特女贞苷组细胞凋亡率、MDA浓度、IL-1β和TNF-α质量浓度、FOXO4蛋白相对表达量均明显降低,SOD活性值明显升高,且呈剂量依赖性;与高糖+si-NC组相比,高糖+si-FOXO4组FOXO4蛋白相对表达量、细胞凋亡率、MDA浓度、IL-1β和TNF-α质量浓度降低,SOD活性值升高;与高糖+特女贞苷+pcDNA组相比,高糖+特女贞苷+pcDNA-FOXO4组细胞凋亡率、MDA浓度、IL-1β和TNF-α质量浓度、FOXO4蛋白相对表达量均明显升高,SOD活性值明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论特女贞苷可保护hRMECs免受高糖损伤,作用机制与其下调FOX4表达抑制hRMECs凋亡、氧化应激和炎症反应有关。

中药复方益糖康颗粒通过AGE-RAGE轴介导SIRT1调控PI3K/Akt/FoxO1信号通路促进足细胞自噬的机制

目的:通过观察中药复方益糖康(YTK)颗粒对晚期糖基化终末产物(AGE)-晚期糖基化终产物受体(RAGE)轴介导沉默信息调节因子1(SIRT1)调控磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/叉头框蛋白O1(FoxO1)信号通路改善糖尿病肾脏疾病(DKD)大鼠足细胞自噬的影响,探讨YTK治疗DKD的可能作用机制。方法:选取8周龄SPF级健康雄性Wistar大鼠96只,使用随机数字表法分为空白组、模型组、YTK高、中、低剂量组(40、20、10 g·kg^(-1))、西药组(氯沙坦片,20 mg·kg^(-1)),采用高脂饲料喂养联合腹腔注射链脲佐菌素建立DKD大鼠模型。造模成功后,各组按照相应比例剂量连续给药8周后取材。严格按照试剂盒所示方法检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)的水平;苏木素-伊红(HE)染色观察肾脏组织病理形态学变化;免疫组化法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)、肌间质蛋白(Desmin)、裂孔膜蛋白(Nephrin)的平均积分吸光度值;蛋白免疫印迹法(Western blot)分析DKD大鼠肾组织中滑膜PI3K、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、Akt、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、RAGE、SIRT1、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、FoxO1的蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组SOD、GSH-Px、CAT表达水平明显降低,MDA显著升高(P<0.01);大鼠呈现严重肾损现象;足细胞标志蛋白α-SMA、FN、Desmin阳性表达显著增多,Nephrin、足突蛋白质(Podocin)显著下降(P<0.01);肾组织中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、RAGE、Caspase-3蛋白表达水平显著升高,SIRT1、FoxO1蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较,YTK各剂量组大鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT水平显著升高,MDA显著下降(P<0.01);肾损程度均发生了不同程度减轻;足细胞标志蛋白α-SMA、FN、Desmin平均积分吸光度值均明显降低,Nephrin、Podocin显著升高(P<0.01);肾组织中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、RAGE、Caspase-3表达水平显著降低,SIRT1、FoxO1表达水平显著提升(P<0.01)。中药组表现出明显的量效趋势。结论:YTK可能通过AGE-RAGE轴介导SIRT1调控PI3K/Akt/FoxO1信号通路,改善足细胞自噬,从而减轻肾脏病理损害,减少蛋白尿,保护肾功能,达到延缓DKD进展的目的。且中药组具有量效趋势。

肾脾阳虚对实验大鼠大脑海马组织衰老相关基因Klotho、Akt、Foxo3a mRNA及蛋白表达的影响

目的:探讨肾脾阳虚致衰老的可能机制,以及桂附理中丸对Klotho、Akt、Foxo3a 3种基因mRNA及蛋白表达的影响。方法:本实验复制肾脾阳虚模型大鼠,通过实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹及免疫组化技术,检测信号转导通路(Klotho-INS/IGF-1-PI3K-Akt-FOXO)中Klotho、Akt、Foxo3a 3种基因的mRNA及蛋白表达。结果:模型大鼠大脑海马组织Klotho蛋白表达减少,信号转导通路下游Akt、Foxo3a的磷酸化反应增强,磷酸化的Akt、Foxo3a蛋白表达均增多;桂附理中丸可增强Klotho mRNA及蛋白表达,抑制Akt、Foxo3a磷酸化,进而升高SOD2(MnSOD)的表达。结论:抗衰老基因Klotho蛋白表达下调是肾脾阳虚大鼠导致衰老的可能机制,同时为肾脾阳虚导致衰老的病理机制提供了分子学基础。

FOXO1、SMAD4在食管癌组织中的表达水平及其与临床病理特征和预后的关系

目的 探讨食管癌(EC)组织中FOXO1和SMAD4的表达水平及其与临床病理特征和预后的关系。方法 收集131例EC患者癌组织和癌旁组织标本。采用苏木精-伊红(HE)染色观察EC组织和癌旁组织病理形态。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定FOXO1 mRNA、SMAD4 mRNA表达;采用免疫组化法测定FOXO1和SMAD4蛋白表达;采用Spearman相关性分析法分析EC组织中FOXO1和SMAD4蛋白表达的相关性;采用Cox回归分析法分析EC患者预后的影响因素;采用Kaplan-Meier分析法进行EC患者生存分析。结果 EC组织中FOXO1 mRNA表达及其蛋白阳性表达率高于癌旁组织,SMAD4 mRNA表达及其蛋白阳性表达率低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。FOXO1、SMAD4与患者肿瘤直径、肿瘤分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05)。EC组织中FOXO1与SMAD4表达呈负相关(r=-0.419,P<0.05)。FOXO1、SMAD4、肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移、TNM分期是EC患者死亡的影响因素(P<0.05)。EC患者3年总生存率为84.73%(111/131)。EC组织中FOXO1阳性表达患者3年累积生存率低于FOXO1阴性表达患者,差异有统计学意义(P<0.05);SMAD4阳性表达患者3年累积生存率高于SMAD4阴性表达患者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 EC组织中FOXO1阳性表达率较高,SMAD4阳性表达率较低,二者蛋白表达与患者临床病理特征和预后有关。FOXO1、SMAD4或可作为预测EC预后的重要标志物。

基于Akt/FoxO信号通路探讨熊果酸对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察熊果酸对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响及具体的分子机制。方法:选用人源结直肠癌细胞RKO为研究对象,用细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测不同浓度的熊果酸(0、5、10、15、20、25、30μmol·L^(-1))处理RKO细胞的增殖抑制率,计算出24、48 h的半抑制浓度(IC50)。后续实验根据熊果酸处理RKO细胞24 h的IC50,选用2个浓度开展。集落形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测熊果酸处理RKO细胞后的凋亡率及细胞周期阻滞情况,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测熊果酸作用RKO细胞24 h,RKO细胞中B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、Raji细胞中Bcl-2、人T淋巴细胞白血病PMA反应基因(Noxa)凋亡蛋白表达情况,细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(p21)、周期蛋白依赖激酶抑制因子1B(p27)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)周期相关的蛋白表达情况,以及蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、叉头框蛋白O3a(FoxO3a)、磷酸化FoxO3a(p-FoxO3a)通路蛋白表达情况。结果:与空白组比较,熊果酸组能够抑制RKO细胞的活力(P<0.05,P<0.01),熊果酸组RKO细胞的克隆形成率明显降低(P<0.05,P<0.01),呈现浓度依赖性;与空白组比较,熊果酸组熊果酸组(20μmol·L^(-1))细胞发生了周期阻滞,在合成前期即G0/G1期明显升高(P<0.05);与空白组比较,熊果酸组(15、20μmol·L^(-1))p21、p27蛋白表达增加,CDK4蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),熊果酸组细胞凋亡率升高,熊果酸组(20μmol·L^(-1))凋亡相关蛋白Bax、Noxa表达升高,Bcl-2表达降低(P<0.05,P<0.01)。与空白组比较,熊果酸组(20μmol·L^(-1))下调p-Akt蛋白的表达,且上调p-FoxO3a的表达(P<0.05,P<0.01),Akt和FoxO3a总蛋白无明显变化。结论:熊果酸能够有效抑制结直肠癌细胞RKO的增殖,促进细胞凋亡,其机制可能与Akt/FoxO途径有关。